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1、該研究根據(jù)已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒PCV-1和PCV-2的全基因序列,利用DNAstar軟件對(duì)PCV-1和PCV-2的全基因序列進(jìn)行同源性比較,應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物,其中一對(duì)PCV特異性引物P1和P2,擴(kuò)增出PCV-1和PCV-2上長(zhǎng)938bp的片段;另一對(duì)為PCV-2型特異性引物P3和P4,擴(kuò)增片段長(zhǎng)490bp.復(fù)合PCR方法可以檢測(cè)到1ng的病毒核酸樣品.建立了定量檢測(cè)豬圓環(huán)病毒DNA的競(jìng)爭(zhēng)PCR方法.PCR擴(kuò)增PCV-
2、2 ORF2上490bp片段P3P4,構(gòu)建了目標(biāo)模板.將P3P4片段應(yīng)用BanⅡ酶切,再進(jìn)行連接,之后克隆到pMD 18-T載體,構(gòu)建含694bp的c-P3P4 DNA片段的競(jìng)爭(zhēng)模板,其攜帶同目標(biāo)DNA和樣本DNA相同的引物結(jié)合區(qū).以定量的競(jìng)爭(zhēng)模板同一系列稀釋的競(jìng)爭(zhēng)模板進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增,結(jié)果當(dāng)反應(yīng)體系中起始模板的量為1.0×10<'7>copies/ml,循環(huán)次數(shù)小于或等于30時(shí),原始模板數(shù)以指數(shù)增長(zhǎng).以獲得目標(biāo)模板濃度和擴(kuò)增產(chǎn)物的熒
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