雞主要病毒性疫病多重感染復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：隨著養(yǎng)雞業(yè)規(guī)?；?、集約化、產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，養(yǎng)雞業(yè)已成為我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，對(duì)促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了巨大的作用。但在我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展過(guò)程中，始終伴隨著雞病的發(fā)生，尤其是雞的傳染性疫病，一旦發(fā)生，常常導(dǎo)致養(yǎng)雞業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，雞傳染性疫病的檢測(cè)和防控對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展尤為重要。本課題以雞馬立克病毒（MDV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞痘病毒（FPV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫

2、病毒（NDV）和傳染性法氏囊病毒（IBDV）為研究對(duì)象。旨在建立一種具有特異性、敏感性、快速、同時(shí)檢測(cè)多種病毒的簡(jiǎn)化復(fù)合 PCR檢測(cè)方法。
　　方法：依據(jù) GenBank中 AIV、IBV、NDV、IBDV、MDV、ILTV、FPV注冊(cè)的基因組序列，經(jīng)不同毒株間序列比對(duì)后，獲得上述病毒株相對(duì)保守序列。利用生物學(xué)軟件在每種病毒的保守序列中設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，7種病毒共設(shè)計(jì)21對(duì)引物，并對(duì)21對(duì)引物進(jìn)行模擬篩選，最終獲得匹配最佳的7對(duì)

3、引物。對(duì)獲得的最佳匹配引物經(jīng)單項(xiàng)PCR驗(yàn)證后，進(jìn)而優(yōu)化復(fù)合PCR反應(yīng)條件，確定最佳的退火溫度、引物濃度和Taq DNA聚合酶的濃度；經(jīng)特異性、敏感性試驗(yàn)及簡(jiǎn)化PCR試驗(yàn)，最終建立了同時(shí)檢測(cè)多種病毒的簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法。
　　結(jié)果：建立了 MDV、ILTV、FPV三種 DNA病毒簡(jiǎn)易復(fù)合 PCR的檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法可同時(shí)擴(kuò)增出3條大小與設(shè)計(jì)相符的特異性片段，即228bp（MDV）、400bp（ILTV）、499bp（

4、FPV）；建立的復(fù)合 PCR方法具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，能同時(shí)檢測(cè)出100fg MDV、ILTV和FPV的DNA。建立了檢測(cè)AIV、IBV、NDV、IBDV四種RNA病毒簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可同時(shí)擴(kuò)增出4條大小與設(shè)計(jì)相符的特異性片段，即146bp（IBV）、215bp（NDV）、345bp（IBDV）、435bp（AIV）；建立的復(fù)合 PCR方法具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，能同時(shí)檢測(cè)出100pg AIV、IBV、