黑龍江省新生仔豬病毒性腹瀉RT-PCR檢測(cè)及LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病毒屬于尼多病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬成員，可以引起新生仔豬嚴(yán)重的嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征的高度接觸性腸道傳染病，各個(gè)年齡階段的豬群都會(huì)發(fā)病，哺乳仔豬病死率高達(dá)100％。自2010年冬季以來，新生哺乳仔豬的腹瀉病開始在全國各地規(guī)?；i

2、場暴發(fā)，本次流行的腹瀉病具有發(fā)病日齡早、死亡率高的新特點(diǎn)。為此本研究在2013-2014年黑龍江省6個(gè)地級(jí)市的10座規(guī)?；i場采取新生哺乳仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉癥狀的糞便與小腸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室RT-PCR病原檢測(cè)分析，結(jié)果表明黑龍江省地區(qū)規(guī)?；i場新生仔豬PEDV RT-PCR檢出率為56％，PEDV+TGEVRT-PCR檢出率為6％，PRV RT-PCR檢出率為10％，TGEV RT-PCR檢出率為10％，表明引起黑龍江省規(guī)?；i場新生仔豬腹瀉

3、的主要病原是PEDV，同時(shí)也存在與其他腹瀉病毒的混合感染，由于PEDV-M基因比較穩(wěn)定，是研究PEDV遺傳變異的優(yōu)先選擇基因，因此針對(duì)陽性病料擴(kuò)增出6條PEDV-M基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，這6條PEDV-M基因序列之間的核苷酸同源性為98.2％～99％，與疫苗株CV777的核苷酸同源性為97.6％～98.2％。利用MEGA6.0進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建，擴(kuò)增出的6條PEDV-M基因的遺傳進(jìn)化樹分為二個(gè)大系，大部分遺傳距離較近，處于同一分支

4、。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14與泰國KU06RB08、泰國KU07RB08的親緣關(guān)系較近，LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14這四株毒株與韓國M1595、韓國CPF259的親緣關(guān)系較近，同時(shí)擴(kuò)增出的6條PEDV-M基因不與CV777毒株為一系，與其親緣性較遠(yuǎn)。說明這些地區(qū)的PEDV流行毒株已經(jīng)發(fā)生變異，形成獨(dú)特的流行進(jìn)化分支，因此新的疫苗毒株和免疫方法的研究對(duì)預(yù)防和控制該病具有重

5、要的意義。
　　本研究進(jìn)一步建立了PEDV的RT-LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank中發(fā)表的PEDV基因序列，用DNAstar軟件進(jìn)行分析對(duì)比后，針對(duì)PEDV-N基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用PrimerExplorer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過嚴(yán)格篩選，最終確定一組引物，包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP。用此引物對(duì)病毒RNA進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，RT-LAMP檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件為:反

6、應(yīng)溫度為61℃，反應(yīng)時(shí)間為50min，Mg2+2.5μL，dNTPs1.5μL，外引物和內(nèi)引物最佳濃度比為1∶4，即外引物(F3∶B3=1∶1)為1μL，內(nèi)引物(FIP∶ BIP=1∶1)為4μL。經(jīng)過靈敏性、特異性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明，RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍，特異性強(qiáng)，且穩(wěn)定性好。用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP方法對(duì)125份樣品提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)后，與RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，二者符合率為100％，該檢測(cè)