桑樹青枯病病原菌的分離鑒定及其活體檢測方法的建立.pdf

1、由青枯菌5號生理小種（Ralstonia solanacearumrace5）引起的桑青枯病是我國一種毀滅性的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，因此早期診斷、盡早防控是控制該病害爆發(fā)流行的重要手段。本研究通過對采自廣東發(fā)病桑園病樹根部組織的病原菌進行分離鑒定、致病性測試分離到一株致病力的青枯菌株 RS-5。通過設(shè)計的青枯菌5號小種特異性引物設(shè)計了熒光定量PCR方法，可有效檢測青枯5號小種菌株。通過使用疊氮溴化丙錠（PMA）對菌株預(yù)處理，

2、建立了青枯菌5號小種的活菌檢測方法。
　　從感染青枯病的桑樹根部組織中分離到了3株具有典型青枯菌形態(tài)的桑青枯病病原菌RS-5，JX-3，GD-3，使用傷根接種法結(jié)合灌根接種法對三株菌進行致病性驗證，其中RS-5可引發(fā)桑樹產(chǎn)生青枯癥狀。對從發(fā)病桑苗中重新分離到的病原菌進行了培養(yǎng)形態(tài)觀察和16S rDNA分子生物學鑒定，該菌與R. solanacearum的同源相似性高達99％，因而將此菌鑒定為青枯菌。
　　通過青枯菌5號小種與

3、其他小種青枯菌的差異片段，篩選到了一對適宜的青枯5號小種特異性引物RS-72F/RS-312R，經(jīng)過電泳驗證和片段回收測序，驗證該引物可特異性的擴增青枯菌5號小種DNA上241 bp的特異性片段，而對于其他小種青枯菌和土壤中其他種屬的微生物均沒有擴增。普通PCR對青枯菌5號小種全基因組DNA的檢測限為50 pg/μL，對青枯菌5號小種菌液的檢測限為1.0×104 CFU/ml。以青枯菌5號小種全基因組DNA和青枯菌5號小種菌液為模板進行

4、熒光定量PCR檢測，在10-4~102ng/μL范圍內(nèi)，DNA濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=?2.747x+21.834(R2=0.993)，在103~107 CFU/mL范圍內(nèi)，菌液濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=?3.418x+45.447(R2=0.998)。
　　利用疊氮溴化丙錠（PMA）對細菌樣本進行預(yù)處理，使用15 ng/μL濃度的PMA，暗孵育10min，強光曝光5 min，可完全抑制1

5、07CFU/mL死菌中的DNA，且不會對活菌DNA的擴增造成影響，在103~107 CFU/mL范圍內(nèi)，PMA-qPCR的Ct值與菌濃的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-3.477x+47.489,R2=0.997。該方法能從活死菌混合體系中有效分辨出活菌。
　　本研究首次建立了桑樹青枯病病原菌青枯菌5號小種的活菌檢測方法，為青枯病的早期檢測和防控提供了一種新的技術(shù)支持，對于減少青枯病造成的損失和保障蠶桑行業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要