環(huán)境因子對副溶血弧菌T3SS基因表達(dá)的影響及養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌多樣性分析.pdf

1、為完善海水養(yǎng)殖病害的防御監(jiān)測機制，通過研究溫度、鹽度和pH等環(huán)境因素對副溶血弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)基因表達(dá)的影響，推斷不同環(huán)境因子影響下副溶血弧菌致病性的差異，以探討環(huán)境因子與副溶血弧菌T3SS基因表達(dá)及致病性和環(huán)境適應(yīng)性之間的關(guān)系，為水產(chǎn)品疾病的防治等研究奠定基礎(chǔ)。同時使用宏基因組測序技術(shù)對大菱鲆養(yǎng)殖水體和病魚腹水水體的細(xì)菌菌群多樣性和相對豐度進行了研究，為大菱鲆養(yǎng)殖過程中的病害防治提供背景資料。
　　以副溶血弧菌ATCC

2、17802和JA21作為實驗菌株，設(shè)置不同培養(yǎng)溫度和溫度應(yīng)激兩種培養(yǎng)條件，以pvuA為內(nèi)參基因，以副溶血弧菌T3SS1的 vcrD1、vopS、vopD1和T3SS2的vscC2β、vcrD2β、vopP2β為目的基因，運用熒光定量PCR技術(shù)檢測T3SS相關(guān)基因在不同生長溫度和溫度應(yīng)激條件下的表達(dá)，用ΔΔCt法計算基因表達(dá)差異。結(jié)果表明，副溶血弧菌ATCC17802的T3SS1基因在16℃表達(dá)量最高，T3SS2基因在25℃表達(dá)量最高；J

3、A21的T3SS基因在25℃表達(dá)量最高。T3SS2能夠破壞腸道組織，并且具有一定的細(xì)胞毒性，是發(fā)揮感染作用的重要毒力因子，由此暗示在25℃條件下，養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌對受感染宿主有較強的致病性。
　　2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入到應(yīng)激溫度37℃后，T3SS1和T3SS2基因的表達(dá)量均被顯著誘導(dǎo)，并表現(xiàn)出時間依賴性，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這為進一步探究環(huán)境因素與副溶血弧菌致病力的關(guān)系提供了科學(xué)依據(jù)。
　　采用RT-P

4、CR的方法，檢測了ATCC1702和JA21這2株副溶血弧菌的T3SS基因在不同鹽度和pH條件下的表達(dá)差異。發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度在2.5％～3.5%之間時，2株副溶血弧菌T3SS基因表達(dá)量最低，而0.5%、5%、8%等過低或過高鹽度下T3SS表達(dá)量顯著增高；2株副溶血弧菌的T3SS在pH為9的堿性環(huán)境下表達(dá)量顯著升高，反應(yīng)強烈；酸性環(huán)境能適度誘導(dǎo)T3SS2的表達(dá)量升高，卻不足以誘導(dǎo)T3SS1的表達(dá)。
　　設(shè)計通過CRISPR/cas9系統(tǒng)構(gòu)

5、建副溶血弧菌Δhns-ATCC17802突變株，熒光定量PCR方法檢測在環(huán)境因子刺激下Δhns突變株的T3SS1及exsA、exsD的表達(dá)情況，并以標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802為對照，研究H-NS是否可以響應(yīng)環(huán)境因子的刺激，對T3SS1的表達(dá)做出調(diào)控。由于未能成功構(gòu)建出hns缺失株，實驗未獲成功，初步分析與啟動子的識別有關(guān)。計劃下一步將從這些方面著手研究。
　　采用高通量測序技術(shù)評估了大菱鲆養(yǎng)殖水體和患病大菱鲆腹水水體樣本的細(xì)菌群落的