七種立克次體甄別檢測(cè)基因芯片的研制.pdf

1、目的：立克次體（Rickettsiae）是一類除極少數(shù)外專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，其引起的立克次體病是一類重要的急性發(fā)熱性人畜共患疾病。目前世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)具有致病性的立克次體有20余種，在我國，根據(jù)感染患者的病原體培養(yǎng)以及免疫學(xué)和分子診斷學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，主要有10種立克次體病，包括：地方性斑疹傷寒、流行性斑疹傷寒、Q熱、恙蟲病、貓抓病、黑龍江蜱傳斑點(diǎn)熱、北亞蜱傳斑點(diǎn)熱、內(nèi)蒙古蜱傳斑點(diǎn)熱以及新發(fā)立克次體病人粒細(xì)胞無形體?。℉GE）和

2、人單核細(xì)胞埃立克體?。℉ME）等。近些年來，斑點(diǎn)熱新種的不斷出現(xiàn)，埃立克體等新發(fā)立克次體的流行，都在提示立克次體病大規(guī)模流行和突然暴發(fā)的可能性。此外立克次體作為潛在的生物恐怖病原體，也日益受到重視，其中落基山斑點(diǎn)熱、Q熱以及流行性斑疹傷寒已被列為生物戰(zhàn)劑。因此，加強(qiáng)立克次體的監(jiān)測(cè)與防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文旨在建立一種能同時(shí)檢測(cè)七種立克次體的化學(xué)發(fā)光基因芯片方法，為立克次體病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的高通量檢測(cè)手段。

3、　　方法：1、根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，確定本研究擬檢測(cè)的病原體及其靶基因。2、收集病原體樣本，無樣本的病原體人工合成基因片段，采用重疊延伸 PCR的方法構(gòu)建其靶基因，然后制備質(zhì)粒參考品。3、設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針，并進(jìn)行篩選。4、通過調(diào)節(jié)體系成分以及引物濃度配比優(yōu)化多重 PCR體系。5、制備陽性參考品和陰性參考品，評(píng)價(jià)芯片特異性；制備靈敏度參考品，評(píng)價(jià)靈敏度；芯片法與實(shí)時(shí)熒光 PCR法同時(shí)檢測(cè)梯度稀釋的莫氏立克次體核酸，比較兩種方法的靈

4、敏度；制備模擬樣本，評(píng)價(jià)芯片檢測(cè)全血樣本的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：首先，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研確定檢測(cè)的7種常見立克次體（莫氏立克次體、查菲埃立克體、普氏立克次體、斑點(diǎn)熱群立克次體、柯克斯氏體、恙蟲病東方體、嗜吞噬細(xì)胞無形體）。構(gòu)建出7種立克次體的質(zhì)粒參考品。對(duì)芯片的引物探針進(jìn)行了篩選。共篩選出1對(duì)通用引物、4對(duì)特異性引物、8條特異性探針和1條立克次體屬通用探針用來擴(kuò)增和檢測(cè)立克次體。對(duì)芯片的多重 PCR體系進(jìn)行了優(yōu)化，重點(diǎn)優(yōu)化了引物濃度配比和

5、引物組合，確保全部靶基因均可以良好的擴(kuò)增。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，芯片共分為兩組三重 PCR體系；建立了立克次體化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測(cè)方法。最后，評(píng)價(jià)了芯片的關(guān)鍵性能指標(biāo)。特異性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，該芯片可以良好的甄別檢測(cè)上述7種立克次體。該芯片檢測(cè)質(zhì)粒 DNA的靈敏度為1.5×102-3×103copies/反應(yīng)，檢測(cè)模擬樣本的靈敏度為103-104 copies/μl。模擬樣本檢測(cè)結(jié)果表明：檢測(cè)符合率為100％。
　　結(jié)論：成功建立了可同時(shí)甄別