腸道重要病原微生物特異分子標識的研究及檢測用基因芯片的研制.pdf

1、O抗原是革蘭氏陰性細菌主要的表面抗原，是由重復寡糖單位組成的多聚糖，由于長期受到來自宿主的選擇壓力，而形成了自然界中最為突出的生物多樣性。編碼合成O抗原的基因簇成為在DNA水平上研究分子進化的最好的材料。通過對其多樣性產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)和進化的研究可以揭示致病菌的進化和形成機理。 志賀氏菌和某些大腸桿菌是人類和許多動物的重要腸道致病菌，并可在特殊情況下導致腸道以外的感染。志賀氏菌與大腸桿菌的進化地位十分接近，有許多共同的生化和分子遺

2、傳學特征。大腸桿菌有160余種O抗原，志賀氏菌有34種不同的O抗原形式，其中13種O抗原為二者所共有。 本文分別以腸道重要致病菌--志賀氏菌和大腸桿菌，為研究對象進行分子檢測和分型方法的研究，篩選了針對34種不同的志賀氏菌O抗原形式(宋內(nèi)氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌2a型、6型、鮑氏志賀氏菌1-18型和痢疾志賀氏菌1-13型)和50種致病性大腸桿菌血清型的特異分子標識，并研制了檢測芯片，共分為兩部分。 第一部分針對34個志賀

3、氏菌血清型，選取具有典型的進化多樣性的表面抗原--O抗原為入手點，鑒定了O抗原的特異基因(鼢、wzy及糖基轉(zhuǎn)移酶基因)。以特異基因為靶基因，在其內(nèi)部共設(shè)計285條寡核苷酸探針，經(jīng)反復篩選驗證得到志賀氏菌血清型的特異探針116條。另外設(shè)計了志賀氏菌通用探針2條，背景檢測探針1條，熒光探針1條，共計120條探針，并點制了芯片。確定了探針最佳點樣濃度為10 μmol/L。進行了雜交液、雜交溫度、雜交時間和洗滌時間等條件的優(yōu)化實驗，和志賀氏菌檢

4、測芯片結(jié)果判讀系統(tǒng)的開發(fā)，并在實驗室內(nèi)部對芯片的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進行評價。本芯片的最低檢出量(DNA含量)為10 ng，最適檢測濃度為50 ng。芯片所能檢測到的最低起始菌濃為1 CFU/25 g奶粉。另外測試了PCR擴增標記體系凍干粉在室溫條件下的穩(wěn)定性和熒光素Cy3-dUTP在使用磷酸甲緩沖液(10 mM，pH 7.0)作1：10稀釋后在-20℃條件下的穩(wěn)定性。對無法用O抗原基因區(qū)分的O抗原相同或非常相近的大腸桿菌和志賀氏菌，

5、我們設(shè)計了基于ipaH和cadA基因引物，用PCR方法實現(xiàn)了對其的區(qū)分，這是對傳統(tǒng)的利用生化表型難區(qū)分問題的有力補充。 第二部分針對腸道重要致病菌，首先在選定的50個致病性大腸桿菌血清型的99個靶基因內(nèi)部，設(shè)計了199條寡核苷酸探針并進行了反復的探針篩選。在確定5種國內(nèi)最常見的致病性最強的大腸桿菌和10種志賀氏菌為腸道重要致病菌檢測芯片的檢測范圍之后，點制了第三代腸道重要致病菌檢測芯片，并開發(fā)了結(jié)果判讀系統(tǒng)。腸道致病菌檢測芯片的

6、主要面對的實際樣品為糞便樣品和食品樣品，新鮮糞便樣品質(zhì)量的1/3為各種腸道內(nèi)正常菌群，細菌的數(shù)量龐大，種類繁多，其含有大量的膽鹽、膽紅素、尿膽素原等PCR抑制劑，影響檢測結(jié)果，因而對糞便樣品、尿液樣品和奶粉樣品摸索了處理方法。最后在實驗室內(nèi)部對芯片的特異性、靈敏度、準確性和穩(wěn)定性進行評價。本芯片的最低檢出量(DNA含量)為10 ng，最適檢測濃度為50 ng。對糞便摸擬樣品，芯片所能檢測到的最低起始菌濃為104 CFU。對100份DNA