人粘膜病原微生物的分子致病機(jī)理及分子診斷學(xué)研究.pdf

1、本研究綜合應(yīng)用細(xì)菌遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及免疫學(xué)等多學(xué)科的研究方法，首先對兩個重要的人體共生病原微生物B族鏈球菌(GBS)和脆弱類桿菌(B.fragilis)的分子致病機(jī)理進(jìn)行了研究；然后以重要致癌病原體人乳頭瘤病毒(HPV)為對象，探索了限制性顯示(RD)和DNA芯片技術(shù)在病原體分子診斷中的應(yīng)用前景。 B族鏈球菌(GBS)是一種革蘭式陽性鏈球菌。它共生于多數(shù)人類胃腸道，并且也是引起新生兒膿血癥，腦膜炎和肺炎

2、等致命性感染的主要病原體。GBS的莢膜多糖(CPS)不僅是其主要的致病決定因子，而且也是其重要抗原。CpsL是莢膜多糖生物合成基因簇中的高度保守基因之一，但其具體功能并未明確。采用了基因定位敲除和遺傳學(xué)互補(bǔ)策略以證實CpsL這一假定的莢膜多糖重復(fù)單位轉(zhuǎn)運分子的功能。 研究表明:人乳頭瘤病毒是導(dǎo)致幾乎所有宮頸癌及其癌前病變的病原體。并且，幾乎所有侵入性宮頸癌病例中都含有致癌型HPV的DNA。因此，對高危致癌性HPVDNA分子進(jìn)行早

3、期診斷對預(yù)防宮頸癌具有重要的臨床意義。作為一種近年來發(fā)展起來的基因診斷和分析技術(shù)，DNA芯片為臨床傳染性疾病的診斷和治療監(jiān)測提供了一種強(qiáng)大的工具。為探索DNA芯片技術(shù)在病原體早期診斷中的應(yīng)用，以HPV作為實驗株，應(yīng)用DNA芯片對HPV的基因檢測和分型進(jìn)行了初步研究。首先，從HPV6、11、16和18型基因組中分離并純化了基因片段作為探針，并將其打印至預(yù)處理的玻片上以制備HPVDNA芯片。然后，應(yīng)用馬文麗教授發(fā)明的限制性顯示(RD)技術(shù)對

4、HPV樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，并將其用于芯片雜交。初步研究結(jié)果顯示，DNA芯片技術(shù)可高度靈敏，準(zhǔn)確地對HPV進(jìn)行檢測并分型，從而顯示了DNA芯片技術(shù)在傳染性病原體早期分子診斷中的應(yīng)用前景。 綜上所述，本研究通過缺失-互補(bǔ)實驗證實了CpsL在GBS莢膜多糖合成中的必要性，并應(yīng)用翻譯融合子技術(shù)確證了CpsL分子的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而提供了有關(guān)GBS這一重要病原體莢膜多糖合成和運輸中的重要機(jī)制。在GBS中構(gòu)建了phoB缺失突變株，為進(jìn)一步研究

5、GBS毒力基因表達(dá)的全局性調(diào)控機(jī)制提供了有力的工具。利用BB170報告菌株，鑒定了GBS中的數(shù)量感應(yīng)通路并應(yīng)用luxS缺失突變株證實了LuxS在這一通路中的重要性，從而為GBS的毒力調(diào)控通路研究提供了新的線索。通過在脆弱類桿菌中構(gòu)建一系列莢膜多糖缺失突變株并對其特性和功能進(jìn)行研究，揭示了有關(guān)脆弱類桿菌與免疫細(xì)胞相互作用的重要信息。應(yīng)用HPV作為實驗株，顯示了綜合應(yīng)用DNA芯片和限制性顯示技術(shù)在病原體早期分子診斷中的可行性和應(yīng)用前景。