納米磁性免疫層析技術(shù)與致病性病原微生物檢測(cè)研究.pdf

1、磁性免疫層析技術(shù)是基于免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)之上，將磁性納米材料的磁信號(hào)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，使免疫層析技術(shù)向定量化、高靈敏度、多元化檢測(cè)、層析系統(tǒng)集成化等方向發(fā)展。納米磁珠是含有鐵元素的超順磁納米顆粒，外面包覆著聚乙烯類高分子物質(zhì)，并可帶羧基或氨基，用于和蛋白質(zhì)分子交聯(lián)。由于磁珠呈球狀，表面積大，在三維空間的各個(gè)方向均可結(jié)合標(biāo)記物；結(jié)合納米磁珠的磁性，運(yùn)用磁性富集的原理，能定量檢測(cè)到微量（pg級(jí)）的標(biāo)記物，為納米免疫磁珠檢測(cè)試劑的研制提供

2、了可能；磁信號(hào)還可通過(guò)磁信號(hào)閱讀儀判讀，從而使檢測(cè)結(jié)果定量化。因此成為近年來(lái)即時(shí)檢驗(yàn)（point of care testing,POCT）技術(shù)發(fā)展的重要內(nèi)容之一。
　　本課題通過(guò)EDC/NHS偶聯(lián)抗體法制備免疫磁珠，并對(duì)每組實(shí)驗(yàn)中層析條件及材料進(jìn)行了優(yōu)化和處理，分別構(gòu)建了單價(jià)免疫層析平臺(tái)、多價(jià)免疫層析平臺(tái)，并在這兩個(gè)平臺(tái)的基礎(chǔ)上研制出了甲型H1N1流感病毒快速層析定量檢測(cè)試紙條和輸血相關(guān)病原微生物（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅

3、毒螺旋體、艾滋病病毒）的多聯(lián)試紙條，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別考察了各自試紙條的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等問(wèn)題，并研究了與層析相關(guān)的材料試劑如磁珠粒徑、加樣量、抗體濃度及用量，以及表面活性劑、大分子物質(zhì)、穩(wěn)定劑和鹽離子等對(duì)層析條件的影響。
　　實(shí)驗(yàn)證明所構(gòu)建的單價(jià)和多價(jià)免疫層析平臺(tái)具有可行性，所建立的人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotrophin,HCG）快速檢測(cè)試紙條和乙肝表面抗原（Hepatitis B vi

4、rus Surface Antigen,HBsAg）快速檢測(cè)試紙條都具有高靈敏度，能夠達(dá)到并超過(guò)同類的膠體金和ELISA產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)，特別是在靈敏度方面HCG可檢測(cè)到1miu/ml的HCG抗原，符合率達(dá)到99％，且時(shí)間控制在5min以內(nèi)；對(duì)HBsAg的檢測(cè)也具有很高的靈敏度（0.1ng/ml），達(dá)到了同類產(chǎn)品膠體金和ELISA的分析標(biāo)準(zhǔn)，時(shí)間也控制在5min內(nèi)；通過(guò)對(duì)甲型H1N1流感病毒抗原檢測(cè)試紙條的研究顯示，肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)下限為10.

5、0ng/ml，通過(guò)MAR磁信號(hào)檢測(cè)儀檢測(cè)最低下限為100pg/ml，高于同類產(chǎn)品膠體金法和ELISA法，通過(guò)臨床樣本的檢測(cè)，磁免疫層析試紙條對(duì)甲型H1N1的敏感度相對(duì)膠體金為85％（38％），與季節(jié)性H3N2的交叉反應(yīng)為10％（60％），與B型流感的交叉反應(yīng)為0％（0％），且兩種方法對(duì)PCR陰性標(biāo)本均無(wú)假陽(yáng)性產(chǎn)生；對(duì)輸血相關(guān)病原微生物的研究表明，將幾種病原微生物的檢測(cè)整合在一個(gè)試紙條上的方式具有一定的困難，靈敏度不高，反應(yīng)速度變慢，還需

6、進(jìn)一步研究影響其靈敏度的因素。基于以上結(jié)果，可以認(rèn)為HBsAg檢測(cè)試紙條和H1N1檢測(cè)試紙條已經(jīng)達(dá)到了臨床應(yīng)用的需求，輸血四項(xiàng)檢測(cè)試紙條對(duì)未來(lái)輸血聯(lián)合檢測(cè)具有重大意義，可以進(jìn)一步研究。
　　本課題將超順磁性納米顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的以膠體金或者乳膠微球?yàn)闃?biāo)記的光學(xué)免疫層析檢測(cè)技術(shù)，建立了具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果客觀便于實(shí)時(shí)記錄保存，適用于平時(shí)、戰(zhàn)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，更重要的是，通過(guò)對(duì)層析試紙的多種檢測(cè)條帶的設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)多價(jià)病原