結(jié)核桿菌主要耐藥基因檢測芯片的制備.pdf

1、目的：用寡核苷酸基因芯片的技術(shù)方法，檢測結(jié)核桿菌耐藥基因的熱點突變，為結(jié)核病的耐藥性診斷探索快速、準(zhǔn)確的基因檢測途徑與方法。 方法與結(jié)果： 第一部分：結(jié)核桿菌檢測基因芯片靶基因克隆及鑒定 本試驗研究采用了直接測序的方法對臨床耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行分析，檢測了結(jié)核桿菌的常見耐藥基因。 1.收集一定數(shù)量且有代表意義的結(jié)核桿菌耐藥株，共提取了34株結(jié)核桿菌的基因組DNA。 2.在gene

2、 bank中檢索結(jié)核桿菌耐藥基因的DNA序列后，設(shè)計并合成靶基因引物序列。 3.采用PCR擴(kuò)增靶基因獲得7個靶基因片段，用pMD18-T克隆和篩選獲得了靶基因重組質(zhì)粒，并通過PCR與酶切鑒定。 4.多重序列比對和Blast分析進(jìn)一步表明：克隆鑒定的靶基因為目標(biāo)病原的高度保守性基因，為結(jié)核桿菌檢測基因芯片的構(gòu)建提供了確實可靠的材料。 第二部分：結(jié)核桿菌檢測基因芯片的構(gòu)建 本試驗研究了結(jié)核桿菌檢測基因芯片靶基

3、因和探針制備方法、靶基因雜交溫度和特異性，確定了構(gòu)建檢測芯片的靶基因及其濃度和有關(guān)芯片質(zhì)量控制方法。 1.靶基因和定位對照基因的制備以靶基因重組質(zhì)粒DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增、異丙醇沉淀法純化靶基因，用熒光素Cy3標(biāo)記的引物對其再次進(jìn)行Exon21、Exon22的PCR擴(kuò)增，其濃度和純度符合芯片制作要求。 2.根據(jù)靶基因常見突變點的情況設(shè)計并合成寡核苷酸探針，5氨基標(biāo)記，制備的探針濃度在121-748ng/μL之間。

4、 3.將探針按一定的順序點樣于醛基化的基片上，制備成基因芯片。 4.用帶有熒光標(biāo)記的靶基因樣本與基因芯片進(jìn)行雜交，顯像，分析并確定結(jié)果。 5.本試驗確定了靶基因最適點樣濃度為300ng/μL，芯片系統(tǒng)靈敏度為3pg/μL探針，篩選出雜交信號強(qiáng)、雜交特異性好的靶基因及其雜交溫度，確定了預(yù)雜交時間為1h和雜交時間為5h。 結(jié)論：本實驗所制備的基因芯片可用于檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性，且具有較高的特異性和敏感性，可用