結核桿菌主要耐藥基因檢測芯片的制備.pdf

1、目的：用寡核苷酸基因芯片的技術方法，檢測結核桿菌耐藥基因的熱點突變，為結核病的耐藥性診斷探索快速、準確的基因檢測途徑與方法。 方法與結果： 第一部分：結核桿菌檢測基因芯片靶基因克隆及鑒定 本試驗研究采用了直接測序的方法對臨床耐藥結核分枝桿菌菌株的耐藥相關基因進行分析，檢測了結核桿菌的常見耐藥基因。 1.收集一定數(shù)量且有代表意義的結核桿菌耐藥株，共提取了34株結核桿菌的基因組DNA。 2.在gene

2、 bank中檢索結核桿菌耐藥基因的DNA序列后，設計并合成靶基因引物序列。 3.采用PCR擴增靶基因獲得7個靶基因片段，用pMD18-T克隆和篩選獲得了靶基因重組質粒，并通過PCR與酶切鑒定。 4.多重序列比對和Blast分析進一步表明：克隆鑒定的靶基因為目標病原的高度保守性基因，為結核桿菌檢測基因芯片的構建提供了確實可靠的材料。 第二部分：結核桿菌檢測基因芯片的構建 本試驗研究了結核桿菌檢測基因芯片靶基

3、因和探針制備方法、靶基因雜交溫度和特異性，確定了構建檢測芯片的靶基因及其濃度和有關芯片質量控制方法。 1.靶基因和定位對照基因的制備以靶基因重組質粒DNA為模板，采用PCR擴增、異丙醇沉淀法純化靶基因，用熒光素Cy3標記的引物對其再次進行Exon21、Exon22的PCR擴增，其濃度和純度符合芯片制作要求。 2.根據(jù)靶基因常見突變點的情況設計并合成寡核苷酸探針，5氨基標記，制備的探針濃度在121-748ng/μL之間。

4、 3.將探針按一定的順序點樣于醛基化的基片上，制備成基因芯片。 4.用帶有熒光標記的靶基因樣本與基因芯片進行雜交，顯像，分析并確定結果。 5.本試驗確定了靶基因最適點樣濃度為300ng/μL，芯片系統(tǒng)靈敏度為3pg/μL探針，篩選出雜交信號強、雜交特異性好的靶基因及其雜交溫度，確定了預雜交時間為1h和雜交時間為5h。 結論：本實驗所制備的基因芯片可用于檢測結核分枝桿菌耐藥性，且具有較高的特異性和敏感性，可用