結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10參照品的制備及其檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、背景：結(jié)核病是經(jīng)呼吸道傳播的慢性傳染病,主要發(fā)生在肺部,是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的世界性重要傳染病?；仡櫺哉{(diào)查結(jié)果表明,我國(guó)結(jié)核病的誤診率可達(dá)24％,提高結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷率已刻不容緩。因此,利用簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢查盡早對(duì)結(jié)核病做出診斷對(duì)控制結(jié)核病疫情至關(guān)重要。目前結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌學(xué)檢查,但是涂片和培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率較低,而且細(xì)菌培養(yǎng)也較費(fèi)時(shí),無(wú)法對(duì)結(jié)核病做出及時(shí)的診斷[2]。由于機(jī)體受到結(jié)核菌感染后,體內(nèi)首先出現(xiàn)的是

2、結(jié)核抗原,因此檢測(cè)結(jié)核抗原有重要的早期診斷價(jià)值,并且結(jié)核抗原的檢測(cè)可以作為結(jié)核桿菌存在的直接證據(jù),且可以避免結(jié)核病患者由于免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的體液免疫檢測(cè)或細(xì)胞免疫檢測(cè)的“假陰性”,因此與檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體相比,檢測(cè)特異性抗原更有可能發(fā)展成為結(jié)核病早期、快速、特異的新型診斷方法。
　　 最早的結(jié)核桿菌抗原是將結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)在含有甘油的液體培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)濾除菌、濃縮制備而成,稱(chēng)為舊結(jié)核菌素。1932年以來(lái),應(yīng)用蛋白純化手段進(jìn)一步

3、純化舊結(jié)核菌素,所得產(chǎn)物即為結(jié)核菌素蛋白衍生物(purified proteinderivation of tuberculin,PPD)。PPD主要用于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skintest),由于其抗原成分復(fù)雜,大多成分為非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)所共有,因此特異性低,不能區(qū)分感染者和卡介苗接種者,同時(shí)對(duì)感染后期的開(kāi)放性結(jié)核和全身性結(jié)核不敏感。
　　 培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate

4、 protein10,CFP10)是近年來(lái)從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)的分子量約為10KDa的高度特異性抗原,為人型結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌所特有,卡介苗(BCG)及非致病分枝桿菌缺乏,具有良好的免疫原性,可作為診斷結(jié)核病的一個(gè)特異性候選抗原[3-4],但通常結(jié)核病患者血清或體液(痰、胸腔積液、腦脊液、關(guān)節(jié)積液等)中CFP10含量非常低,用ELISA、膠體金免疫層析等方法檢測(cè),難以達(dá)到理想的效果。
　　 時(shí)間分辨熒光免疫分析

5、技術(shù)(time-resolve fluoroimmunoassay,TRFIA)是自80年代以來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種新型標(biāo)記分析技術(shù),與其它免疫標(biāo)記分析技術(shù)相比,有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。它克服了放射性免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)中放射性同位素帶來(lái)的污染問(wèn)題；克服了酶免疫分析法(Enzyme immunoassay,EIA)中酶不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；而且,由于鑭系元素獨(dú)特的熒光特點(diǎn)和TRFIA檢測(cè)中采用的波長(zhǎng)分辨和時(shí)間延遲技術(shù),能夠

6、很好的消除背景熒光的干擾,并可通過(guò)解離增強(qiáng)技術(shù),使熒光信號(hào)放大百萬(wàn)倍,使其靈敏度比普通熒光法(Fluoroimmunoassay,FIA)高出幾個(gè)數(shù)量級(jí),具有靈敏度高(10-8 mol/孔)操作簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便且穩(wěn)定、無(wú)放射性污染、多標(biāo)記等特點(diǎn)[5],目前已經(jīng)成為了一種極具臨床應(yīng)用潛力的超微量分析技術(shù)。
　　 我們通過(guò)基因工程技術(shù)制備了CFP10的三種重組蛋白,CFP10及鏈親

7、和素標(biāo)記的CFP10/SA,將重組抗原進(jìn)行純化、復(fù)性、鑒定后,應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù),以雙抗體夾心法建立反應(yīng)模式并優(yōu)化條件。然后分別對(duì)CFP10、CFP10/SA在分析靈敏度、穩(wěn)定性方面進(jìn)行比較,篩選出最優(yōu)的靶標(biāo)蛋白做為檢測(cè)CFP10的參考標(biāo)準(zhǔn)品,并初步建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)CFP10的方法。
　　 目的：制備CFP10的三種重組蛋白,CFP10及鏈親和素標(biāo)記的CFP10/SA,從中篩選出合適的靶標(biāo)蛋白做為檢測(cè)CF

8、P10的參考標(biāo)準(zhǔn)品,并初步建立時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)CFP10的方法。
　　 方法：
　　 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)CFP10的基因序列及所選載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV全基因組為模板,加入PCR相關(guān)試劑,擴(kuò)增CFP10片段,并根據(jù)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)與pET21a-SA載體及pET24b、pET24b-SA載體進(jìn)行酶切后連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,從轉(zhuǎn)化抗性平板上挑取若干單克隆菌落,進(jìn)行菌落PC

9、R鑒定及雙酶切鑒定,選擇鑒定成功者送公司雙向測(cè)序。
　　 2.重組蛋白的表達(dá),純化將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta,分別挑取3個(gè)單克隆菌落接種于3 ml LB標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6時(shí),加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,分別選用不同溫度和不同的誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),比較不同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響,對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)誘導(dǎo)條件,大量擴(kuò)菌表達(dá),收集菌體,加入裂解液,冰浴超聲裂解

10、細(xì)菌,通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)形式,并對(duì)包涵體表達(dá)的蛋白以本室發(fā)明的五步洗滌法予以洗滌。將洗滌后包涵體經(jīng)8M尿素充分溶解后,經(jīng)鎳金屬螯合層析柱(Ni-NTA)分離純化,對(duì)于可溶性表達(dá)的重組蛋白則收集破菌后的上清經(jīng)過(guò)濾后直接經(jīng)親和層析柱純化。
　　 3.重組蛋白的復(fù)性及Western blotting鑒定將純化后的變性蛋白濃度調(diào)整至0.2 mg/mL,在大于50倍體積的透析液(50mmol/L Tris-HCl,5

11、M尿素,0.5 M L—Arg,0.1％PEG8000,0.5 M EDTA)中,4℃尿素梯度(5M-3M-2M-1M-0M Urea)透析復(fù)性,每4h換液一次至0 M尿素,最后用50 mmol/L Tris-Hcl(PH8.0)緩慢透析12-24h,離心收集上清。并在透析過(guò)程中觀察透析袋中蛋白的溶解度,是否渾濁或有沉淀形成,復(fù)性后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察復(fù)性效果。
　　 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,利用濕電轉(zhuǎn)法

12、將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。0.2％的麗春紅染色,觀察轉(zhuǎn)移效果,滿(mǎn)意后,用封閉液(5％脫脂奶粉,PBST配制)37℃孵育2h,洗膜,加入封閉液稀釋的小鼠CFP10單克隆抗體,37℃孵育2h,洗膜,加入PBST稀釋的二抗HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1h,充分洗膜后,加入DAB試劑顯色,顯色合適時(shí),去離子水終止。
　　 4.時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)CFP20參照品的篩選鑒定應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù),以雙抗體夾心法對(duì)建

13、立反應(yīng)模式并對(duì)包被抗體和標(biāo)記抗體的濃度進(jìn)行優(yōu)化。然后分別對(duì)CFP10、SA/CFP10在分析靈敏度、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行比較,選擇合適的靶標(biāo)蛋白做為檢測(cè)CFP10的參考標(biāo)準(zhǔn)品,并對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)品在線性、精密度及特異性等方面進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建的三個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果與GeneBank中收錄的SA及CFP10序列進(jìn)行比對(duì),均完全一致且無(wú)讀碼錯(cuò)誤。
　　 2.重組蛋白的表

14、達(dá)、純化將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體經(jīng)超聲波破菌,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示SA—CFP10及CFP10-SA分子量均在30KDa左右,與理論值基本相符,表達(dá)量分別約占菌體總蛋白25％和30％左右。CFP10分子量在10KDa左右與理論值基本相符,其表達(dá)量約占菌體總蛋白35％左右。融合蛋白SA/CFP10主要以包涵體形式存在于破菌后沉淀,而CFP10重組蛋白則以可溶形式存在于破菌后上清中。融合蛋白

15、SA/CFP10洗滌包涵體后,可溶性CFP10重組蛋白過(guò)濾后,均經(jīng)Ni-NTA,His—tag純化,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,三種重組蛋白的純化效果均較好,純度均可達(dá)90％以上。
　　 3.重組蛋白的復(fù)性及Western blotting鑒定將純化后的融合蛋白CFP10/SA置于透析袋內(nèi),于透析液中尿素梯度4℃透析復(fù)性,SDS-PAGE電泳結(jié)果可看到非還原條帶上有聚體出現(xiàn)(鏈親和素SA本身可形成四聚體)。將可溶性表達(dá)的CFP

16、10于2M輕微變性后,以等同于CFP10/SA的復(fù)性條件復(fù)性。經(jīng)Western blotting鑒定,三種重組蛋白均可與進(jìn)口CFP10單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 4.時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)CFP10參照品的篩選鑒定我們建立了時(shí)間分辨熒光雙抗體夾心法,并對(duì)包被抗體和標(biāo)記抗體進(jìn)行濃度優(yōu)化,以正交試驗(yàn)確定最優(yōu)條件為:包被抗體濃度為3μg/mL,標(biāo)記抗體濃度為0.8μg/mL。對(duì)自制的CFP10-SA、SA-CFP10及CFP

17、10在分析靈敏度、穩(wěn)定性方面進(jìn)行了比較,證明CFP10-SA為最優(yōu),其線性范圍為0-80ng/ml,最低檢測(cè)濃度可達(dá)0.02ng/ml,分別在37℃放置7天,14天,21天,28天,其最大降解率低于8％,為最優(yōu)。通過(guò)對(duì)其精密度分析,批內(nèi)的CV<6％,批間的CV<5％,精密度良好。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,CFP10-SA與SA-IL15、SA-GM-CSF、ESAT6、SA-ESAT6、ESAT6-SA均無(wú)交叉反應(yīng),特異性良好。繪制雙對(duì)數(shù)函數(shù)

18、TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其R2=0.9997,相關(guān)性良好,而且具有較好的重復(fù)性。該參考標(biāo)準(zhǔn)品的成功篩選,及雙抗體夾心法時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)CFP10方法的初步建立,為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10時(shí)間分辨熒光分析檢測(cè)試劑盒及其臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功制備了CFP10-SA、SA-CFP10及CFP10重組蛋白。
　　 2.初步建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)CFP10的方法,并篩