結核桿菌蛋白芯片-ELISA診斷技術研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病。據估計，全球約有20億的人口感染結核病，精準、及時高效地對結核病病人進行診斷是治療和控制結核病所必需的。結核菌素實驗（PPD）是目前臨床診斷牛結核病常規(guī)的方法，也是國際動物衛(wèi)生組織與我國規(guī)定的法定檢疫手段。然而由于PPD抗原也許包含有與其它分枝桿菌相同的抗原成份,檢測時診斷結果假陽性高,而且此診斷方法不能區(qū)分自然感染和卡介苗免疫。此外還有其他許多結核桿菌的診斷方法如痰涂、菌培、

2、結核桿菌DNA擴增法檢測法等,但這些方法不但需要昂貴的儀器設備和專業(yè)的人員操作，而且具有檢測時間長、操作過程繁瑣、診斷結果敏感性低等缺點,最終導致目前結核病臨床檢出率低，說明以上檢測方法不利于結核病的檢測。為此，本實驗研究了新型的結核病的快速診斷方法：
　　 采用多抗原多組分作為聯合診斷抗原的方法，建立一種靈敏度好，高特異性的血清學診斷方法。提取結核分枝桿菌H37Rv的基因組DNA，采用分子克隆表達技術擴增TB9.7、38KD、

3、MPB83和MPB70基因片段，通過pET-32a構建質粒載體pET-32a-TB9.7、pET-32a-38KD、pET-32a-MPB83和pET-32a-MPB70，經測定序列正確后轉化大腸桿菌BL21(DE3),通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組蛋白的含量，同時用蛋白純化試劑盒，完成ESAT-6、CFP10、ACR、Rv2626c、TB9.7、38KD、MPB83、MPB70和FadB4的蛋白純化，并且進行western blot檢

4、測。將九種抗原分別進行iELISA條件的優(yōu)化，制備可視化簡易蛋白芯片，建立“芯片”式iELISA診斷方法，并確定了ELISA診斷方法的判斷標準，即S/P≥任一抗原陽性臨界值為陽性,S/P<所有抗原陰性臨界值為陰性。ELISA方法的特異性為97.5%，敏感性為73.3%。對30份痰檢陽性和120份健康人血清樣品進行了檢測,并與痰檢結果比較。30份痰檢陽性血清樣品中有22份為ELISA檢測陽性,陽性符合率為73.3%,120份健康人血清，3