應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)研究葉酸對體外缺氧胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá).pdf

1、目的:
　　 探討應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface-enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)測試不同劑量葉酸(folic acid，F(xiàn)A)作用下缺氧胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，從中篩選出差異表達(dá)蛋白，明確葉酸對其相關(guān)作用通路的保護(hù)機(jī)制。

2、
　　 方法:
　　 原代培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞，獲得NSCs并分為5組:①正常對照組(Control)葉酸濃度為4μg/ml;②缺氧模型組(Hypoxia)葉酸濃度為4μg/ml;⑨缺氧葉酸低劑量組(Hypoxia+Folate-L)葉酸濃度為8μg/ml;④缺氧葉酸高劑量組(Hypoxia+Folate-H)葉酸濃度為44μg/ml;⑤缺氧葉酸缺乏組(Hypoxia+Folate-D)葉酸劑量為0.65μg/ml;于增殖

3、第3d將除正常對照組外的其他4組細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，8h后取出，繼續(xù)培養(yǎng)至第7d收集增殖期細(xì)胞;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察;用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)缺氧損傷后的各組細(xì)胞密度;MTT法檢測葉酸對細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響;采用弱陽離子交換芯片(WCX-2)蛋白芯片檢測不同葉酸劑量下胎鼠NSCs蛋白表達(dá)差異;結(jié)果采用Biomarker Wizard軟件進(jìn)行分析，通過查詢蛋白庫，對特定分子質(zhì)量所對應(yīng)的標(biāo)記蛋白進(jìn)行初步確定;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組的凋亡率及細(xì)胞周期;采用We

4、stern blot方法檢測各組NSCs MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白(pERK1/2、pJNK1/2、P38)表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)37℃，5％CO2、1％O2、94％N2條件缺氧8h后，NSCs形態(tài)及計(jì)數(shù)上都顯示出損傷跡象，成功建立體外胎鼠NSCs缺氧損傷模型。MTT結(jié)果顯示:每組隔天之間MTT值均有差別(P＜0.05)。除24h時(shí)間點(diǎn)外，經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)得出葉酸不同劑量組與對照組相比均有差別(P＜0.05)，除

5、Hypoxia+Folate-D組隨時(shí)間MTT OD值呈下降趨勢以外，其余四組隨時(shí)間MTT OD值均呈上升趨勢，之后有所下降。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞密度結(jié)果顯示，Hypoxia組與其余四組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Hypoxia+Folate-H組最高、Hypoxia+Folate-D組最低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)檢測結(jié)果顯示:Hypoxia+Folate-L組的

6、細(xì)胞凋亡率最低，Hypoxia+Folate-D組凋亡率最高。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示Hypoxia+Folate-H組的S期較活躍，Hypoxia+Folate-D組和Hypoxia組相較不活躍。蛋白芯片結(jié)果提示:葉酸補(bǔ)充可促進(jìn)NSCs增殖;每組芯片上均捕獲到81種蛋白質(zhì)點(diǎn)，篩選出不同葉酸劑量組與Control組之間的差異蛋白共34種，其中有5個(gè)蛋白存在顯著性差異（P＜0.05）。初步推斷這些蛋白與NSCs凋亡相關(guān)，且在不同葉酸劑量組圖譜

7、表達(dá)不同。Western blot結(jié)果顯示，各組NSCs pERKl/2蛋白表達(dá)量與Control組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中Hypoxia+Folate-H組表達(dá)量最高(P＜0.05)，Hypoxia+Folate-D組最低(P＜0.05)。除與Control組和Hypoxia+Folate-L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），其余各組NSCs pJNK1/2蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Hyp

8、oxia+Folate-D組表達(dá)量最高(P＜0.05)，Hypoxia+Folate-H組最低(P＜0.05)。 Hypoxia+Folate-D與Control、Hypoxia+Folate-L、Hypoxia+Folate-H組NSCs P38蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)成功建立體外胎鼠NSCs缺氧模型，研究結(jié)果顯示葉酸可以促進(jìn)缺氧損傷的NSCs增殖，抑制或減緩細(xì)胞凋亡。葉