褪黑素對體外腦缺氧模型中神經(jīng)干細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、褪黑素melatonin(5-methoxy-N-acetyltryptamine)，是一種廣泛存在的小分子吲哚胺類物質(zhì)，從單細(xì)胞藻類到靈長類動(dòng)物都有存在。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)是一種主要由松果體合成分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是存在于從藻類到人類等眾多生物中的一種荷爾蒙，它在生物體內(nèi)的含量水平隨每天的時(shí)間變化而變化。褪黑素的分泌受晝夜節(jié)律性的調(diào)節(jié)，分泌高峰主要出現(xiàn)在夜晚，而白天分泌減少。調(diào)節(jié)褪黑素分泌晝夜節(jié)律性的主要中樞位于下丘腦的視交叉上核(su

2、prachiasmaticnuclei，SCN)，主要通過多突觸連接來調(diào)節(jié)松果體的功能。由于褪黑素是一種脂溶性激素，所以它不但可以通過血腦屏障，而且可以通過下丘腦屏障直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)，尤其在各種腦損傷中，褪黑素更是通過損傷的血腦屏障直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)。在人體內(nèi)可參與調(diào)節(jié)多個(gè)系統(tǒng)的功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素受體在不同發(fā)育程度的大鼠胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)區(qū)域均有表達(dá)，且在小鼠NSCs，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上都有褪黑素受體(mel

3、atonin receptor)的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明褪黑素可能參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
　　 氧是細(xì)胞能量代謝的重要底物，是細(xì)胞新陳代謝的重要調(diào)控環(huán)節(jié)，機(jī)體一系列的病理狀態(tài)均伴隨缺氧的發(fā)生，其中腦組織對氧的需求量大，而儲(chǔ)存量又很少，所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧最為敏感，耐受性低。缺氧會(huì)影響干細(xì)胞生存的微環(huán)境狀態(tài)，雖暫時(shí)性促進(jìn)NSCs增殖，卻最終抑制了NSCs的增殖，使其增殖數(shù)量減少，且使其分化不良。NSCs是指神經(jīng)系統(tǒng)中具有干細(xì)

4、胞特征的細(xì)胞群體，能自我更新和分化，可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞群，用于各種腦損傷和退行性病變的治療。但是，褪黑素對缺氧損傷的神經(jīng)干細(xì)胞有沒有作用，有什么樣的作用，以及其可能的機(jī)制是什么，至今尚未見報(bào)道。
　　 因此，我們利用NSCs體外缺氧模型來模擬腦缺氧環(huán)境，采用MTT，免疫熒光、RT-PCR和Western blot等技術(shù)方法，研究褪黑素對體外缺氧NSCs的作用及其可能發(fā)揮作用的作用機(jī)制。
　　

5、 一、NSCs的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增
　　 NSCs體外培養(yǎng)成功與否取決于動(dòng)物種屬、年齡、取材部位、接種密度、培養(yǎng)基營養(yǎng)條件及促有絲分裂因子的選擇等。研究發(fā)現(xiàn)，相比于新生鼠和成年鼠，胚胎鼠腦皮質(zhì)中NSCs含量最高，且胚胎來源的NSCs體外分離培養(yǎng)時(shí)具有更高的擴(kuò)增能力和分化潛能。其中胎齡12-15天的胚胎中NSCs的增值分化潛能處于高峰。
　　 實(shí)驗(yàn)選用了孕12.5天的小鼠胚胎體外分離培養(yǎng)NSCs，在體視鏡下分離胚胎神經(jīng)管前端

6、腦泡，經(jīng)機(jī)械吹打獲取細(xì)胞懸液，接種于無血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得神經(jīng)前體細(xì)胞(neuralprogenitor cells，NPCs)，應(yīng)用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記以及巢蛋白(Nestin)免疫熒光染色技術(shù)檢測其增殖和更新能力，采用神經(jīng)元特異性抗體微管相關(guān)蛋白2(microtubuleassociated protein2，MAP2)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體膠質(zhì)原纖維酸性

7、蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫熒光染色法檢測了其分化情況。實(shí)驗(yàn)顯示，獲得的是具有增殖能力和分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們體外分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有較好的增值能力和自然分化能力，完全可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 二、褪黑素對體外缺氧NSCs增殖分化的影響
　　 為了研究不同濃度褪黑素對NSCs細(xì)胞活性的影響，我們用MTT法檢測細(xì)胞活

8、性來篩選了最佳的藥物濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置0，1 nm，10 nm，100 nm，1μm，10μm，100μm七個(gè)濃度梯度，結(jié)果顯示，特定濃度的褪黑素可提高NSCs的細(xì)胞活性，而且該作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)褪黑素的濃度達(dá)到100nM時(shí)，細(xì)胞的活性最高，所以我們選用100nM的褪黑素濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。
　　 體外模擬腦缺氧模型，體外培養(yǎng)的NSCs體外缺氧12h作為模擬腦缺氧的體外模型，利用MTT檢測了缺氧后NSCs的細(xì)胞活

9、性，結(jié)果顯示體外缺氧后NSCs細(xì)胞活性明顯降低，說明神經(jīng)干細(xì)胞體外缺氧模型是成功的。我們把實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)組，正常對照組(CT)，正常加藥組(CT+MT)，缺氧組(Hy)，缺氧加藥組(Hy+MT).各個(gè)對照組和處理組之間均存在顯著性差異，說明褪黑素可顯著提高細(xì)胞的細(xì)胞活性。且褪黑素對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的促進(jìn)作用在缺氧后的第3天最明顯。后我們又通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)來檢測褪黑素對體外缺氧神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響，缺氧后四組細(xì)胞分別在缺氧后第3天檢

10、測細(xì)胞增殖，BrdU免疫熒光染色結(jié)果顯示干細(xì)胞的增殖高峰在第3天。
　　 對于NSCs體外缺氧處理后，分成上述四組進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，分別在分化的第3，5，7，9天進(jìn)行GFAP和MAP2的免疫熒光染色標(biāo)記分化的細(xì)胞，染色后計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示缺氧明顯抑制了NSCs向神經(jīng)元方向的分化，而褪黑素則有效補(bǔ)救了這一后果，明顯促進(jìn)了NSCs向神經(jīng)元方向的分化。褪黑素對向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化沒有明顯變化，但卻可以明顯促

11、進(jìn)向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，使膠質(zhì)細(xì)胞的分化明顯提前。
　　 三、褪黑素影響體外缺氧NSCs增殖分化的機(jī)制研究
　　 為了研究褪黑素促進(jìn)NSCs增殖的機(jī)制，我們檢測了NSCs表面的受體表達(dá)情況，分別從基因和蛋白的水平上檢測到了褪黑素Ⅰ型受體的表達(dá)。而MAPK信號(hào)通路是褪黑素作用與神經(jīng)系統(tǒng)的重要信號(hào)通路，MAPK又是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的主要信號(hào)通路。我們再加入褪黑素處理后的5、15、30、60和75 min四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集NSCs

12、，通過Western blot檢測了ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，ERK1/2可被褪黑素所激活，而活化型ERK1/2即p-ERK1/2的水平在5min開始升高，至30 min到達(dá)到高峰，之后開始下降，至75 min接近正常水平，而細(xì)胞內(nèi)總的ERK1/2的水平則沒有明顯變化。加入褪黑素受體的抑制劑(Luzindole)后，p-ERK1/2的活化水平和細(xì)胞的增殖率均明顯低于單純褪黑素作用組，而和對照組水平接近。這表

13、明，褪黑素確可通過與NSCs表面的褪黑素受體結(jié)合，通過誘導(dǎo)ERK1/2的快速磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。提示ERK1/2的活化參與了褪黑素對體外缺氧NSCs增殖的促進(jìn)作用。
　　 為了研究褪黑素對體外缺氧NSCs分化的可能機(jī)制，我們應(yīng)用RT-PCR方法檢測了與NSCs分化密切相關(guān)的bHLH家族主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，Neurog1、NeuroD2、Mash1、Id1和Hes5的mRNA水平與對照組相比均有顯著升高。其中Ne

14、urog1、NeuroD2、Mash1和Id1四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不僅mRNA水平高于對照，并且在褪黑素處理組的峰值均比對照組提前出現(xiàn)。
　　 四、褪黑素對體外缺氧NSCs凋亡的影響機(jī)制研究
　　 以往的研究顯示，褪黑素有神經(jīng)保護(hù)作用，但其分子機(jī)制不明。本研究采用體外缺氧的方法，建立穩(wěn)定的體外缺氧模型。結(jié)果顯示，褪黑素治療組同對照組相比細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯降低，與以往的研究結(jié)果相一致。為了探討褪黑素抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們檢測了B

15、cl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，褪黑素處理組活化型caspase-3和Bax的表達(dá)水平明顯低于體外缺氧處理組，Bcl-2蛋白則明顯升高，提示Caspase3、Bax和Bcl-2共同參與了褪黑素對體外缺氧后NSCs的抗凋亡作用。
　　 結(jié)論：
　　 褪黑素能促進(jìn)體外缺氧的NSCs的細(xì)胞活性，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。褪黑素能促進(jìn)體外缺氧的NSCs的增殖，并上調(diào)ERK1/2的蛋白磷酸化。褪黑素能調(diào)