缺氧對神經(jīng)干細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制探討.pdf

1、缺氧是最常見在病理因素之一，在一些臨床疾病和特殊軍事勞動(dòng)作業(yè)中常有發(fā)生。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的研究為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧損傷的治療開辟了新的領(lǐng)域。在腦損傷后，NSCs能向相應(yīng)的腦組織部位遷移、增殖并分化成為子代神經(jīng)細(xì)胞參與組織的修復(fù)和功能的重建。闡明缺氧對NSCs生物學(xué)特性的影響及調(diào)控的分子機(jī)制，不但能為有效拮抗缺氧的病理損害提供理論依據(jù)，而且對于臨床缺氧相關(guān)疾病的防治和保障特殊軍事勞動(dòng)作業(yè)環(huán)境中人員的健康，提高軍隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力具有重要的意義。

2、缺氧對NSC的影響分直接效應(yīng)和通過引起微環(huán)境改變而產(chǎn)生間接效應(yīng)兩個(gè)方面。本課題擬在體外培養(yǎng)的NSCs模型上，通過研究缺氧對NSCs上CXCR4表達(dá)的直接影響，以及缺氧后小膠質(zhì)細(xì)胞上清液對NSC的間接效應(yīng)觀察，來探討NSCs功能是否受到缺氧應(yīng)激環(huán)境的調(diào)控。同時(shí)，從缺氧刺激CNS內(nèi)源性大麻素含量增加的現(xiàn)象入手，進(jìn)一步觀察內(nèi)源性大麻素對NSCs分化的影響及STAT3相關(guān)分子機(jī)制，探討NSCs的分化受到缺氧間接調(diào)節(jié)的可能途徑。本課題為深入了解缺

3、氧對NSCs生物學(xué)特性的影響及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為缺氧相關(guān)疾病的防治提供新的線索。 一、缺氧對NSCs上CXCR4表達(dá)的影響 目的：觀察不同缺氧條件下，CXCR4在NSCs上的表達(dá)改變，進(jìn)而探討缺氧影響NSCs功能的分子機(jī)制。 觀察指標(biāo)與方法： 1.采用體外培養(yǎng)NSCs細(xì)胞，分為對照，缺氧(1％O2)4h，缺氧16h，以及缺氧4h+復(fù)氧(21％O2)8h、缺氧16h+復(fù)氧8h五組。通過RT-PCR

4、，Westernblot檢測各時(shí)相點(diǎn)NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 2.采用缺氧16h的培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞株的上清培養(yǎng)液，分別孵育NSCs4h、16h，通過RT-PCR，Western-blot檢測各時(shí)相點(diǎn)NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 3.采用培養(yǎng)N9細(xì)胞進(jìn)行對比研究，分別缺氧4h、16h，通過RT-PCR，Westemblot檢測各時(shí)相點(diǎn)NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的變化。并

5、通過transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察缺氧對細(xì)胞遷移能力的影響。 主要結(jié)果： 1.缺氧處理4h和16h，未能引起NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的明顯改變。在缺氧4h+復(fù)氧8h、缺氧16h+復(fù)氧8h兩組上，也沒有觀察到CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的明顯改變。 2.缺氧16h后N9細(xì)胞的上清培養(yǎng)液孵育NSCs4h、16h，均未觀察到NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)的明顯改變。 3.缺氧4h、16

6、h后，N9細(xì)胞上CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并導(dǎo)致了細(xì)胞遷移能力的顯著性增強(qiáng)。 結(jié)論：直接缺氧和小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后的上清液處理都不能引起NSCs上CXCR4的表達(dá)改變，而相同的缺氧條件卻能上調(diào)N9細(xì)胞上CXCR4的表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。這提示對CXCR4的表達(dá)的調(diào)控可能不是缺氧影響NSCs功能的機(jī)制之一。 二、STAT3在內(nèi)源性大麻素2-AG促NSCs膠質(zhì)分化中的作用 目的：觀察內(nèi)源性大麻素2-AG對N

7、SCs分化的影響及STAT3信號通路在其中的作用。 觀察指標(biāo)與方法： 1.采用RT-PCR，檢測NSCs上CB1和CB2mRNA表達(dá)情況；采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)，觀察CB1和CB2在NSCs上的蛋白表達(dá)。 2.采用1μM，10μM2-AG分別處理NSCs2d和6d，通過細(xì)胞免疫熒光化學(xué)，觀察NSCs分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞比例的改變。 3.采用1μM，10μM2-AG分別處理NSCs15min、30min

8、、60min，通過Western-blot，檢測STAT3磷酸化水平的變化；利用STAT3抑制劑Stattic及CB1、CB2受體拮抗劑AM251、AM630預(yù)處理1h，通過Western-blot進(jìn)一步觀察2-AG對STAT3磷酸化水平的影響。 4.通過EMSA，檢測10μM2-AG處理1h對NSCs上STAT3核轉(zhuǎn)位與DNA結(jié)合的影響；通RT-PCR，檢測1μM，10μM2-AG處理1h對STAT3下游基因GFAPmRNA表

9、達(dá)的影響。 5.采用Western-blot，檢測1μM，10μM2-AG處理30min對NSCs上JAK1-3和Src磷酸化水平的影響。 6.采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)，觀察STAT3抑制劑Stattic對2-AG誘導(dǎo)的NSCs膠質(zhì)分化的影響。 主要結(jié)果： 1.在體外培養(yǎng)NSCs上，能檢測到CB1和CB2mRNA表達(dá)。而且，CB1和CB2蛋白均與Nestin蛋白有共表達(dá)。 2.兩種劑量2-AG均能引起

10、NSCs膠質(zhì)分化的比例顯著上升。 3.兩種劑量2-AG均能引起STAT3磷酸化水平的顯著上調(diào)，SFAT13抑制劑及CB1受體拮抗劑能阻斷這一效應(yīng)，而CB2受體拮抗劑卻無顯著影響。 4.2-AG能引起STAT3DNA結(jié)合增強(qiáng)，并且能導(dǎo)致其下游基因GFAPmRNA表達(dá)上調(diào)。而這一效應(yīng)能被STAT3抑制劑及CB1受體拮抗劑阻斷。 5.兩種劑量2-AG均不能引起JAK1-3磷酸化水平的顯著改變，卻能顯著上調(diào)Src磷酸化水