刺參多糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)因具有有自我更新和多向分化潛能，成為治療神經(jīng)退行性疾病及腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新途徑。NSCs作為未來神經(jīng)組織修復(fù)的種子細(xì)胞，移植后細(xì)胞的存活和功能的建立仍然存在許多問題。如何調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移也是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，許多學(xué)者正在尋找能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞遷移和增殖的藥物，提高細(xì)胞移植的治療效果，以達(dá)到修復(fù)損傷神經(jīng)組織的目的。近年來，刺參多糖及其復(fù)合物已被報(bào)道在抗腫瘤，抗凝

2、血等方面的藥理活性，而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用研究還較少見。本課題以從鮮刺參中提取分離得到的刺參多糖(SJP)為原料，研究SJP對(duì)NSCs體外遷移的影響，并探討SJP促進(jìn)NSCs體外遷移的作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.刺參多糖分離純化及性質(zhì)測(cè)定
　　 從新鮮海參體壁中提取得到刺參多糖粗提物，將粗提物經(jīng)過DEAE-Sepharose離子交換層析后得到SJP1、SJP2、SJP3、SJP4四個(gè)多糖組分。通過體外神經(jīng)球

3、遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)多糖組分進(jìn)行活性篩選，收集活性組分SJP3。對(duì)SJP3進(jìn)行SephacrylS-200HR凝膠柱層析得到SJP3-1和SJP3-2兩個(gè)多糖組分，活性檢測(cè)表明SJP3-1具有促進(jìn)神經(jīng)球遷移作用，因此我們將SJP3-1（以下簡(jiǎn)寫SJP）用于隨后實(shí)驗(yàn)。
　　 苯酚硫酸法測(cè)得SJP中總糖含量為57.18％，硫酸咔唑法測(cè)得糖醛酸含量為12.39％，BaCl2-明膠比濁法測(cè)得硫酸鹽含量29.75％。考馬斯亮藍(lán)法和UV光譜分析表明，

4、SJP不含游離蛋白質(zhì)和核酸成分。IR光譜圖顯示SJP具有硫酸化多糖典型的紅外吸收特征。高效凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明，SJP為均一組分，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得SJP相對(duì)分子量為1.79×10Da。旋光儀測(cè)得SJP的0.1％水溶液的比旋度[α]20D-48.62°。
　　 2.刺參多糖對(duì)體外NSCs作用研究
　　 首先，建立神經(jīng)前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成懸浮的神經(jīng)球體系。我們從E14.5天Wistar大鼠的胚胎腦組織中分離獲得細(xì)胞，

5、用添加生長(zhǎng)因子EGF和bFGF的DMEM/F12+B27培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。免疫熒光染色檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中Nestin表達(dá)，2％血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化，對(duì)分化后細(xì)胞進(jìn)行GFAP和Tuj1免疫熒光染色檢測(cè)。結(jié)果表明細(xì)胞Nestin免疫熒光染色鑒定陽性，且誘導(dǎo)分化后能定向分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。因此，我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 然后我們研究不同濃度SJP對(duì)體外NSCs遷移、存活、增殖及分化的作用。體外神經(jīng)球遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SJP

6、能夠劑量依賴性促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球粘附于培養(yǎng)表面并遷移。利用Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，對(duì)SJP對(duì)NSCs增殖作用影響進(jìn)行檢測(cè)，Hoechst/PI雙染檢測(cè)SJP對(duì)NSCs凋亡的影響，結(jié)果顯示SJP能夠維持NSCs在撤除生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)條件下的存活能力。免疫熒光染色對(duì)SJP作用后細(xì)胞類型變化進(jìn)行鑒定，顯示SJP能夠促進(jìn)遷移的細(xì)胞向神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞分化。RT-PCR結(jié)果顯示，SJP能下調(diào)NestinmRNA水平，上調(diào)GFAP及Tuj1的mR

7、NA水平。
　　 3.SJP促進(jìn)NSCs體外遷移的機(jī)制研究
　　 利用RT-PCR及westernblot檢測(cè)SJP作用后N-cadherin在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，SJP能夠劑量依賴性地上調(diào)N-cadherin表達(dá)。通過阻斷信號(hào)通路，分別研究了SJP作用過程中ERK，BMP和PI3K/Akt信號(hào)通路參與情況。結(jié)果顯示，PI3K抑制劑LY294002抑制SJP激活的Akt磷酸化，并顯著抑制SJP的促進(jìn)神

8、經(jīng)球遷移作用。同時(shí)，LY294002預(yù)處理顯著抑制SJP引起的N-cadherin蛋白表達(dá)升高，而ERK抑制劑(PD98059)和BMP抑制劑(Noggin)對(duì)這些現(xiàn)象沒有影響。綜上，我們認(rèn)為SJP促進(jìn)NSCs遷移的作用機(jī)制為:SJP通過上調(diào)Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使粘附分子N-cadherin表達(dá)增高，促使神經(jīng)球粘附于培養(yǎng)表面并發(fā)生細(xì)胞遷移。
　　 本論文研究表明刺參硫酸化多糖SJP能夠促進(jìn)胚胎NSCs的遷