刺參多糖對神經(jīng)細胞作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　 神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全球首位致殘疾病和第3位主要致死因素。如腦中風(fēng)會引起大腦損傷區(qū)域神經(jīng)元和神經(jīng)元連接廣泛缺失，導(dǎo)致長期的神經(jīng)功能障礙。目前藥物干預(yù)主要局限在急性期的腦損傷保護，如重組組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)僅適合于急性期恢復(fù)腦供血等。尚不能對中風(fēng)引起的長期神經(jīng)功能障礙起到有效的治療和恢復(fù)作用。因此，尋找能有效恢復(fù)損傷后亞急性期和慢性期神經(jīng)功能的治療方法，藥物或保健食品意義都非常重大。
　　 在我國，

2、海參一向被視為藥食兩用的海產(chǎn)佳品，其中尤以刺參為佳。刺參廣泛應(yīng)用于年老體弱者，記憶力減退者，中風(fēng)患者術(shù)后以及神經(jīng)退行性疾病患者的保健和恢復(fù)?？梢姶虆︻A(yù)防神經(jīng)衰退，增強和恢復(fù)神經(jīng)組織功能發(fā)揮積極作用，且食用刺參沒有副作用。所以，深入研究刺參活性成分的藥理作用對發(fā)揮刺參在維護人民身體健康方面具有重要的意義，同時也為刺參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的作用。本研究從刺參體壁中分離獲得具有藥理活性的刺參多糖，探討其對神經(jīng)細胞的作用方式及其作用機制。

3、>　　 實驗方法:
　　 1.刺參多糖的分離純化、活性篩選和理化性質(zhì)鑒定
　　 實驗采用為胃蛋白酶/胰蛋白酶雙酶解法，乙醇沉淀獲得粗多糖，大孔吸附樹脂脫色，用DEAE-sepharose陰離子交換柱分離，獲得A、B、C、D四個多糖組分，用SephacrylS-200凝膠進一步純化并脫鹽。將分離獲得的組分分別用神經(jīng)干細胞球遷移實驗（HS-3活性最好）和星形膠質(zhì)細胞活化實驗進行活性篩選（HS-4活性最好）。選取有活性的單一

4、多糖組分進行理化性質(zhì)鑒定，采用HPLC法做純度檢查，自動旋光儀檢測比旋光度，苯酚硫酸法檢測總糖含量，硫酸咔唑法檢測糖醛酸含量，明膠BaCl2法檢測硫酸根含量，Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量，凝膠色譜法檢測多糖分子量。
　　 2、HS-3促進神經(jīng)干細胞球遷移作用研究。
　　 本實驗從孕14.5天胎鼠大腦皮層分離神經(jīng)干細胞，培養(yǎng)在含EGF、FGF-2的培養(yǎng)基中。相差顯微鏡測量HS-3在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（無EGF/FGF-2）促

5、進神經(jīng)干細胞球遷移的距離，用Hoechst/PI雙染法檢測細胞存活情況，用BrdUlabeling法檢測細胞的增殖狀態(tài)，免疫熒光法觀察神經(jīng)干細胞在含HS-3的培養(yǎng)基中的分化狀態(tài)，用信號通路抑制劑（PI3K抑制劑LY294002，ERK抑制劑PD98059，BMP抑制劑noggin）、Westernblotting和RT-PCR技術(shù)檢測HS-3誘導(dǎo)細胞粘附和遷移可能的作用機制。
　　 3、HS-4與FGF-2協(xié)同誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活

6、化作用研究
　　 星形膠質(zhì)細胞活化主要包括三個方面:1）細胞形態(tài)變化;2）細胞由靜息期進入細胞分裂期，細胞增殖;3）細胞發(fā)生遷移。本實驗從新生大鼠大腦中經(jīng)胰酶消化分離，機械振蕩法純化獲得星形膠質(zhì)細胞。首先通過MTT法檢測HS-4對細胞的毒性作用以確定后續(xù)試驗的使用濃度和作用時間。用伊紅染色和免疫熒光染色法觀察HS/FGF-2誘導(dǎo)細胞的形態(tài)變化，westernblotting檢測星形膠質(zhì)細胞特征蛋白GFAP的表達情況。BrdU插入

7、法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化情況，Westernblotting檢測細胞周期調(diào)控蛋白CycD(1)表達水平。Transwell法檢測HS-4/FGF-2促進細胞遷移作用。用細胞通路抑制劑（Rho通路抑制劑Y27632，P(1)3K抑制劑LY294002，ERK抑制劑PD98059，P38抑制劑SB203580，JNK抑制劑SP600125）、免疫熒光和Westernblotting技術(shù)檢測HS-4/FGF-2誘導(dǎo)細胞形態(tài)變

8、化可能的作用機制。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、刺參多糖的分離純化與理化性質(zhì)鑒定
　　 本實驗通過離子交換色譜分離獲得四個多糖組分，經(jīng)細胞活性檢測確定HS-3具有促進神經(jīng)干細胞球遷移和分化作用;HS-4對誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活化的作用效果最為顯著。經(jīng)鑒定，HS-3的理化性質(zhì)為:HPLC檢測確定其為均一物質(zhì)，分子量約為1.79×105Da，旋光度為[α]D20-48.62°(c0.1，H2O)，總糖含量為57.18％，

9、酸性多糖含量為12.39％，SO42-含量為29.75％。HS-4的理化性質(zhì)為:分子量為4.23×l05Da，總糖含量為38.12％，酸性多糖含量為16.52％，硫酸根含量為32.64％，單糖組分主要以巖藻糖為主，還含有小部分半乳糖，不含蛋白質(zhì)和核酸。
　　 2、HS-3促進神經(jīng)干細胞球遷移作用研究。
　　 從胎齡為E(1)4.5d胚胎大腦皮層中提取的神經(jīng)干細胞，在含有外源性生長因子bFGF和EGF存在的條件下細胞會分裂

10、增殖，聚集成團，即神經(jīng)細胞球。經(jīng)鑒定提取的神經(jīng)干細胞BrdU染色呈陽性，Nestin熒光染色呈陽性，經(jīng)含2％胎牛血清誘導(dǎo)后可以分化為星形膠質(zhì)細胞（GFAP陽性）和神經(jīng)元細胞（TUJ1陽性）。HS-3能誘導(dǎo)神經(jīng)球在未鋪P-L-L的培養(yǎng)板中粘附和遷移，遷移距離呈現(xiàn)濃度依賴性，在80μg/mLHS-3作用72h后，神經(jīng)球的遷移距離為438μm。HS-3還能有效維持神經(jīng)球在撤離生長因子后細胞的存活。在HS-3的刺激下，神經(jīng)干細胞能分化為神經(jīng)元和

11、星形膠質(zhì)細胞，濃度增加，分化為神經(jīng)元的比例增大;且更有意義的是分化的神經(jīng)元細胞能沿著神經(jīng)球軸線向外遷移，而分化的星形膠質(zhì)細胞滯留在神經(jīng)球中。PD98059和Noggin對HS-3介導(dǎo)的細胞遷移沒有影響，而LY294002能有效抑制神經(jīng)球的遷移(P＜0.01)，且LY294002的預(yù)處理能有效抑制HS-3誘導(dǎo)的Akt（ser-473）蛋白磷酸化水平的升高及N-cadherin蛋白表達水平的升高。因此，HS-3誘導(dǎo)神經(jīng)球遷移可能的作用機制是

12、通過N-cadherin蛋白介導(dǎo)的，PI3K/Akt活化的信號通路。
　　 3、HS-4與FGF-2協(xié)同誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活化作用研究
　　 從新生大鼠大腦中分離的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)機械振蕩法純化后，GFAP染色鑒定陽性率在97％以上，體外培養(yǎng)的細胞在體外傳代2次以后，細胞骨架發(fā)生變化，形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，邊界模糊，細胞進入G0/G1期，處于細胞靜息狀態(tài)。HS-4聯(lián)合FGF-2共同作用后膠質(zhì)細胞形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，由靜息狀態(tài)的多角形，

13、邊界模糊，無明顯突觸突起轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸鄠€突觸突起，細胞呈星形，邊界清晰，細胞染色變亮。Westernblotting檢測GFAP蛋白表達水平顯著提高。表明HS/FGF-2刺激后細胞骨架蛋白發(fā)生重組，形態(tài)改變。細胞BrdU陽性率顯著上升，由對照組的13.04％增加到55.29％，表明經(jīng)HS-4誘導(dǎo)后大部分細胞進入細胞分裂期。流式細胞術(shù)檢測細胞周期顯示，經(jīng)HS/FGF-2處理后，大量細胞由G0/G1進入S期，細胞周期素CycD(1)表達水平明顯

14、升高。靜息態(tài)細胞不能穿過Transwell膜，即無遷移活性，經(jīng)HS/FGF-2誘導(dǎo)活化后的星形膠質(zhì)細胞具有遷移活性，能穿過Transwell膜。上述結(jié)果證實HS-4能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活化。
　　 PI3K抑制劑能輕微抑制HS-4/FGF-2誘導(dǎo)的膠質(zhì)細胞活化作用，ERK抑制劑能完全抑制星形膠質(zhì)細胞的活化，JNK抑制劑幾乎沒有任何抑制作用，而P38抑制劑反而在一定程度上能促進HS-4/FGF-2誘導(dǎo)的活化作用。培養(yǎng)液加入EGTA通

15、過結(jié)合Ca2+可以抑制細胞的活化。Rho-Rock抑制劑能迅速促進星形膠質(zhì)細胞活化。
　　 結(jié)論:
　　 本實驗從刺參體壁中獲得了兩種富含硫酸基的酸性多糖且對神經(jīng)細胞具有不同的活性作用。其中HS-3促進神經(jīng)干細胞球的粘附和遷移，維持神經(jīng)球的存活，誘導(dǎo)細胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，作用機制可能是通過N-cadherin蛋白介導(dǎo)的，激活PI3K/Akt信號通路完成。HS-4與FGF-2能協(xié)同誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞的活化，由靜息態(tài)