DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，也稱嘔吐毒素，由鐮刀菌屬霉菌產(chǎn)生，具有神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性以及“三致”作用等。為了研究DON對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本試驗(yàn)以仔豬的海馬神經(jīng)細(xì)胞為模型，進(jìn)行體外培養(yǎng)，用不同濃度的DON(0125、250、500、1000、2000 ng/mL）進(jìn)行染毒處理，運(yùn)用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;利用Hoechest33258染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)

2、行標(biāo)記，觀察核的變化;采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的存活率以及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)LDH漏出率;利用鈣離子(Ca2+)、鈣調(diào)蛋白(CaM)檢測(cè)試劑盒以及熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、CaM含量及CaM mRNA表達(dá)量;利用5-羥色胺(5-HT)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)5-HT含量;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量以及蛋白免疫印跡技術(shù)(WB)檢測(cè)MAPKs通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3、量。
　　結(jié)果顯示:
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:(i)對(duì)照組細(xì)胞呈不規(guī)則的放射狀，細(xì)胞飽滿致密;處理組細(xì)胞密度降低，皺縮，突起消失，成圓點(diǎn)狀。(ii)對(duì)照組細(xì)胞胞核形狀完整且規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻，胞漿致密，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整;處理組細(xì)胞隨著DON濃度的增加，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮凝集于核膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞器損傷，大量空泡化。當(dāng)DON濃度達(dá)到2000 ng/mL時(shí)，核膜消失，染色質(zhì)溶于胞質(zhì)內(nèi)，出現(xiàn)凋亡小體。(iii)經(jīng)Hoechest

4、33258染色，對(duì)照組胞核呈顏色均勻的淡藍(lán)色，而處理組胞核顏色與對(duì)照組相比，較明亮，且隨著DON濃度的增加，胞核明亮程度增加且數(shù)量增多。
　　2.細(xì)胞活性及細(xì)胞膜完整性變化:與對(duì)照組相比，隨著DON濃度的增大，處理組細(xì)胞的存活率極顯著降低(P＜0.01);LDH漏出率逐漸增大，當(dāng)DON濃度較低時(shí)，與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞的LDH漏出率雖有增多，但無(wú)差異顯著性(P＞0.05);當(dāng)DON濃度達(dá)到500 ng/mL以上時(shí)，LDH漏出率明

5、顯高于對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)。
　　3.5-HT含量及鈣穩(wěn)態(tài)變化:與對(duì)照組相比，胞內(nèi)5-HT含量隨DON濃度的增加而增高，且差異呈極顯著變化（P＜0.01）;胞內(nèi)Ca2+、CaM含量以及CaM mRNA表達(dá)量亦隨著DON濃度的增加而升高，當(dāng)DON濃度達(dá)到250 ng/mL以上時(shí)，呈極顯著差異(P＜0.01)。
　　4.細(xì)胞凋亡率:仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率隨著DON濃度的增加而增大，與對(duì)照組相比，DON處理組的細(xì)胞

6、凋亡率極顯著升高（P＜0.01）。
　　5.MAPKs通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平:JNK、ERK、p38的蛋白表達(dá)量隨著DON濃度的增加而降低，與1000 ng/mL DON處理組相比，DON(1000 ng/mL)+SP600125、DON(1000ng/mL)+U0126或DON(1000 ng/mL)+SB202190組的JNK、ERK或p38的蛋白表達(dá)量升高。隨著DON濃度的增加，p-JNK、p-p38的蛋白表達(dá)量增加，而p-E

7、RK的蛋白表達(dá)量降低。與1000 ng/mL DON處理組相比，DON(1000 ng/mL)+SP600125、DON(1000 ng/mL)+U0126或DON(1000 ng/mL)+ SB202190組的p-JNK、p-ERK或p-p38的蛋白表達(dá)量降低。p-JNK/JNK和p-p38/p38的值隨著DON濃度的升高而升高，且差異極顯著(P＜0.01)，而p-ERK/ERK比值極顯著降低。與1000 ng/mL DON處理組相比

8、，DON(1000 ng/mL)+SP600125、DON(1000 ng/mL)+U0126或DON(1000 ng/mL)+SB202190組的p-JNK/JNK、p-ERK/ERK或p-p38/p38極顯著降低(P＜0.01)。
　　6.凋亡基因表達(dá)水平:隨著DON濃度的增加，Bax mRNA表達(dá)量增加，Bcl-2mRNA表達(dá)量降低，當(dāng)DON濃度達(dá)到250 ng/mL時(shí)，Bax/Bcl-2比值極顯著升高(P＜0.01)。與1

9、000 ng/mL DON處理組相比，DON(1000 ng/mL)+SP600125和DON(1000 ng/mL)+SB202190的Bax/Bcl-2比值極顯著降低(P＜0.01);而DON(1000 ng/mL)+U0126的Bax/Bcl-2比值極顯著升高（P＜0.01）。
　　綜上所述，DON暴露對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的毒性作用，可以造成細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，DON能夠通過(guò)MAPKs信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡