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文檔簡介
1、目的:
應(yīng)用酒精和Tat蛋白制作PC12細(xì)胞和鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,觀察丹參配方顆粒和丹參有效成分對酒精及Tat蛋白損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,探討酒精、Tat蛋白對神經(jīng)細(xì)胞損傷及丹參保護(hù)的作用機(jī)制。
方法:
MTT法檢測細(xì)胞存活率;酶標(biāo)法檢測PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性;Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化;應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)和Annexin V/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞儀檢
2、測PC12細(xì)胞凋亡情況;相關(guān)試劑盒測定超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PX)的活性和丙二醛(MDA)的量;DCFH-DA染色法檢測胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;Western-blotting法檢測細(xì)胞凋亡信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變;TUNEL法檢測腦片神經(jīng)細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞突觸前體蛋白突觸素?cái)?shù)量的變化;DiI金顆粒散射標(biāo)記對樹突棘進(jìn)行定量分析。
結(jié)果:
3、酒精對PC12細(xì)胞生長具有抑制作用,且呈濃度依賴性(P<0.05)。不同濃度的丹參配方顆粒對PC12細(xì)胞存活率影響不顯著(P>0.05),但用丹參溶液作用于800mmol/L濃度酒精損傷的PC12細(xì)胞時(shí),0.2μg/ml的丹參溶液能夠顯著減少細(xì)胞損傷,這種保護(hù)作用在一定濃度范圍內(nèi)(0.2-1.0μg/ml)隨丹參濃度的增加而增強(qiáng)(P<0.05),說明丹參對酒精所致PC12細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。酒精損傷造成PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,出現(xiàn)
4、染色質(zhì)凝聚,核固縮,DNA片段化,而后出現(xiàn)凋亡小體;TUNEL和Annexin V/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞儀檢測顯示800mmol/L酒精處理24h后細(xì)胞凋亡率與對照組相比明顯高(P<0.01);細(xì)胞氧化-抗氧化相關(guān)物質(zhì)或酶發(fā)生變化,ROS、MDA含量明顯升高,抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX活性明顯降低(P<0.01)。Western Blotting檢測結(jié)果顯示800mmol/L酒精處理后細(xì)胞BAX蛋白相對表達(dá)量增加、Casp
5、ase-3出現(xiàn)活性片段蛋白相對表達(dá)量增加、BCL-2蛋白相對表達(dá)量下降(P<0.01)。同時(shí)加入1μg/ml丹參配方顆粒后與酒精處理組相比,細(xì)胞MDA含量和ROS水平降低,細(xì)胞抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX酶的活性升高(P<0.01);且細(xì)胞BAX蛋白相對表達(dá)量減少、Caspase-3兩活性片段蛋白相對表達(dá)量減少、BCL-2蛋白相對表達(dá)量增加(P<0.01)。鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)酒精處理4d后出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡(P<0.01),
6、神經(jīng)細(xì)胞突觸素和樹突棘數(shù)量明顯減少(P<0.01),同時(shí)加入1μg/ml丹參配方顆粒后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.01),且細(xì)胞突觸素和樹突棘數(shù)量與酒精處理組相比明顯增加(P<0.01)。
Tat蛋白對PC12細(xì)胞生長具有抑制作用,且呈濃度依賴性(P<0.05),不同濃度的丹酚酸A對PC12細(xì)胞存活率影響不顯著(P>0.05),但用丹參溶液、丹酚酸A作用于0.16μmol/L濃度Tat蛋白損傷的PC12細(xì)胞時(shí),丹參溶液和
7、丹酚酸A均能夠顯著減少細(xì)胞損傷(P<0.05),說明丹參和丹酚酸A對Tat所致PC12細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)Tat蛋白處理4d后出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡,Tat蛋白損傷引起腦片神經(jīng)細(xì)胞樹突棘數(shù)量減少(P<0.01),同時(shí)加入丹參配方顆粒、丹酚酸A后腦片神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.01),且神經(jīng)細(xì)胞樹突棘數(shù)量顯著增多(P<0.01)。
結(jié)論:
(1)丹參配方顆粒對酒精誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和鼠腦片神經(jīng)細(xì)
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