外周神經(jīng)損傷對DRG和脊髓神經(jīng)細胞GIRK家族蛋白表達的影響.pdf

1、傷害性神經(jīng)元興奮性的增強是慢性疼痛發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。多種離子通道，包括鈉離子通道、鈣離子通道和鉀離子通道在控制神經(jīng)元的興奮性上起到重要作用。G蛋白門控內(nèi)向整流鉀離子（GIRK）通道已被證實能夠調(diào)控神經(jīng)元的興奮性。此前的研究報道GIRK通道四個亞單位的mRNA在大鼠和人類背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中均有所表達。功能性的GIRK通道是由其亞單位成員中的一個或兩個組成的同源四聚體或異源四聚體。GIRK通道通過與抑制性G蛋白偶聯(lián)受體（G protei

2、n coupled receptors，GPCRs）的相互作用而被激活并開放，鉀離子外流，使膜電位變得更“負”，從而降低神經(jīng)元的興奮性。本論文旨在系統(tǒng)地研究GIRK通道亞單位在正常大鼠DRG和脊髓中表達的神經(jīng)化學特性，以及通過構(gòu)建外周神經(jīng)損傷的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型研究外周神經(jīng)損傷對GIRK通道四個亞單位的表達調(diào)控，分析和闡述GIRK通道在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用。
　　本研究利用免疫組織化學實驗和定量分析等方法確定

3、了GIRK通道亞單位在正常大鼠腰椎4-5（L4-5）節(jié)段DRG組織和L5脊髓組織中的表達和分布情況。在正常大鼠DRG中~70％和<10%的神經(jīng)元分別表達GIRK1和GIRK2。利用降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、植物凝集素B4（IB4）和神經(jīng)絲蛋白-200（NF200）抗體分別標記DRG中的小型無髓鞘肽能神經(jīng)元、小型無髓鞘非肽能神經(jīng)元和中大型有髓鞘神經(jīng)元，激光共聚焦共定位研究結(jié)果表明GIRK1和GIRK3廣泛地表達于這三種神經(jīng)元類群，而G

4、IRK2僅表達于CGRP和NF200陽性神經(jīng)元類群。進一步使用四種鈣離子結(jié)合蛋白鈣結(jié)合蛋白D28k（CB）、鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）、小清蛋白（PV）和促泌素蛋白（Scgn）抗體標記不同的DRG神經(jīng)元類群，對GIRK通道亞單位的表達特性進行進行地分析，結(jié)果表明GIRK1與四種鈣離子結(jié)合蛋白均存在不同程度上的共定位關(guān)系，而GIRK2只在CB陽性神經(jīng)元中表達。為分析GIRK1~4在脊髓背角中的表達特性，使用不同的標記物分別標記DRG神經(jīng)元軸突在

5、脊髓背角投射末端分布的薄層（lamina），其中，GIRK1和GIRK2主要表達于lamina Ⅱ，GIRK3和GIRK4主要表達于lamina I和外層lamina Ⅱ。此外，GIRK1~4與VGLUT1或VGLUT2的共定位研究結(jié)果表明GIRK1~4在脊髓背角存在突觸前膜定位。利用神經(jīng)元標記物NeuN標記脊髓背角神經(jīng)元，結(jié)果表明GIRK1和GIRK2廣泛地表達于不同lamina區(qū)域的局部神經(jīng)元，但是GIRK3和GIRK4不表達于局部

6、神經(jīng)元。
　　為研究外周神經(jīng)損傷對GIRK通道亞單位表達調(diào)控，我們通過大鼠坐骨神經(jīng)離斷（axotomy）手術(shù)制備了外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛模型。通過免疫組織化學實驗、原位雜交實驗、實時熒光定量PCR實驗、western blot實驗和定量分析等方法對GIRK1~4在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達情況進行分析。結(jié)果表明損傷側(cè)DRG和脊髓背角中GIRK1、GIRK2和GIRK4的表達均顯著下調(diào)，而GIRK3的表達顯著上調(diào)。結(jié)合此

7、前的研究結(jié)果進行分析，GIRK3表達的上調(diào)能夠降低神經(jīng)元細胞膜的GIRK1/2和GIRK2/2通道。
　　為研究GIRK通道亞單位在DRG神經(jīng)元中的軸突轉(zhuǎn)運，分別利用大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎（ligation）模型和脊髓神經(jīng)背根切除（rhizotomy）模型研究在DRG神經(jīng)元中合成的GIRK1~4向外周端和中樞端運輸情況。實驗結(jié)果表明GIRK1~4均存在向外周和中樞運輸?shù)捻樞修D(zhuǎn)運，此外，GIRK1~3存在外周軸突末端向胞體端運輸?shù)哪嫘修D(zhuǎn)運

8、。利用免疫組織化學實驗，進一步檢測了GIRK1~4在正常大鼠坐骨神經(jīng)和后爪無毛皮膚中的表達和分布，結(jié)果表明GIRK1~4廣泛地表達于包括感覺纖維在內(nèi)的多種類群的神經(jīng)纖維，且GIRK1~4均表達于后爪無毛皮膚真皮層中的神經(jīng)末端。
　　綜上所述，本研究首次系統(tǒng)地闡述了GIRK通道四種亞單位在大鼠DRG和脊髓中表達的神經(jīng)化學特性，并通過外周神經(jīng)損傷模型和多種分子生物學實驗方法證明了GIRK通道在神經(jīng)病理性疼痛情況下的表達下調(diào)。GIRK通