顱腦外傷后繼發(fā)性損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體基因表達(dá)的影響.pdf

1、顱腦外傷（traumatic brain injury，TBI）占全身創(chuàng)傷性疾病的第二位，但致死、致殘率則高居第一位。死亡原因除原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性損傷也占有很大比重。顱腦外傷后繼發(fā)性腦損害的機(jī)制復(fù)雜，在受傷后即刻或數(shù)小時(shí)內(nèi)，可出現(xiàn)腦代謝和離子平衡改變，腦水腫和顱內(nèi)壓增高，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放改變，氧自由基的產(chǎn)生等一系列病理生理變化，造成神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。大量研究證實(shí)，傷后數(shù)小時(shí)逐漸發(fā)展形成的繼發(fā)性腦缺血，可能是顱腦外傷后腦損傷的主要病理過程

2、。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量生成和儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所，對(duì)缺血、缺氧極為敏感。隨著學(xué)科的發(fā)展和研究水平的不斷提高，國(guó)內(nèi)外關(guān)于顱腦外傷后繼發(fā)性損傷與線粒體損傷之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)也在逐步深入。所以，進(jìn)一步研究顱腦外傷后線粒體的病理生理變化對(duì)闡釋繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制，揭示對(duì)病患預(yù)后的影響，指導(dǎo)臨床治療和提高病患生活質(zhì)量都有十分重要的意義。 目的：線粒體氧化磷酸化過程是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要來(lái)源。一旦受到缺血、缺氧等不利影響而出現(xiàn)線粒體功能障礙將直接影響到

3、細(xì)胞整體功能甚至出現(xiàn)細(xì)胞壞死、凋亡。本研究針對(duì)在線粒體能量代謝（氧化磷酸化）過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CO）為研究方向。因線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）缺乏細(xì)胞核DNA的糾錯(cuò)、修復(fù)等功能，較核DNA更易受到損傷，故本實(shí)驗(yàn)選取僅由線粒體DNA編碼合成的CO-Ⅰ，CO-Ⅱ，CO-Ⅲ亞單位mRNA作為具體研究指標(biāo)，觀察顱腦外傷后繼發(fā)性腦損傷對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞線粒體

4、DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化情況，探討其不同時(shí)間、部位的變化規(guī)律以及可能出現(xiàn)的機(jī)體代償性保護(hù)機(jī)制。 方法：將44只成年雄性SD大鼠（250-300g）隨機(jī)分為對(duì)照組（n=4），假手術(shù)組（n=20），外傷組（n=20）。假手術(shù)組和外傷組又分為5個(gè)亞組（6小時(shí)，1天，3天，5天，7天）。對(duì)照組麻醉后處死取檢，假手術(shù)組僅予以右側(cè)頂骨鉆孔術(shù)，外傷組行右側(cè)項(xiàng)骨鉆孔術(shù)和Feeney經(jīng)典自由落體腦外傷模型致局部腦皮層挫裂傷。假手術(shù)組和外傷組按分組情況在

5、不同時(shí)間處死取檢。上述操作均在麻醉和無(wú)菌條件下進(jìn)行。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別對(duì)腦挫傷灶周圍皮層組織（距挫裂傷灶邊緣2mm，前、后、側(cè)方各取-4mm×1mm×1mm組織塊）和對(duì)側(cè)大腦半球挫傷灶對(duì)稱部位皮層組織進(jìn)行檢測(cè)，觀察線粒體DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化情況，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 1．RNA提取; 組織樣品經(jīng)勻漿、兩相分離、離心、沉淀、清洗、再溶解得到RNA溶液，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)測(cè)定RNA濃度和純度。 2．cDNA合成;

6、 使用樣品的RNA進(jìn)行cDNA合成。 3．實(shí)時(shí)定量PCR; 合成的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR：（1）制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板；（2）樣品使用特定的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并根據(jù)所得到的PCR產(chǎn)物熔解曲線，計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果：1．大體觀察和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)中所有44只SD雄性大鼠體重變化無(wú)顯著性差異。顱骨鉆孔術(shù)和腦外傷模型制作過程中，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和假手術(shù)組各亞組的標(biāo)

7、本檢測(cè)值在時(shí)間或取檢部位上均無(wú)顯著性差異。 2．CO-Ⅰ mRNA含量變化：顱腦外傷后挫裂傷周圍皮層組織CO-Ⅰ mRNA含量在傷后6小時(shí)即出現(xiàn)下降（～90．08％），第3天降至最低（～22．02％），后逐漸回升，但至第7天仍明顯低于對(duì)照組水平（～51．46％）。傷后24、72、120、168小時(shí)組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)側(cè)腦皮層組織CO-Ⅰ mRNA含量在傷后6小時(shí)出現(xiàn)短暫升高，傷后第1天降至略低于對(duì)照組水平

8、后開始回升，至第5天升至峰值（～119．35％）后再次出現(xiàn)下降，其均值略高于對(duì)照組（～102．938％），但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．CO-Ⅱ mRNA含量變化：腦挫裂傷周圍皮層組織CO-Ⅱ mRNA含量變化趨勢(shì)與CO-Ⅰ mRNA變化趨勢(shì)相似。相對(duì)于對(duì)照組，顱腦外傷后6小時(shí)傷灶周圍皮層CO-Ⅱ mRNA相對(duì)含量即出現(xiàn)下降（～81．95％），傷后3天下降至最低（～18．34％）后逐漸回升，但至傷后第7天仍明顯低于對(duì)照組（～4

9、9．25％）。傷后24、72、120小時(shí)組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)側(cè)腦皮層組織CO-Ⅱ mRNA含量無(wú)明顯下降，其均值略高于對(duì)照組（～103．202％）。從傷后6小時(shí)開始出現(xiàn)輕度升高，至第3天升達(dá)峰值（～116．36％）后下降。各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．CO-ⅢmRNA含量變化：CO-ⅢmRNA含量在腦挫裂傷灶周圍皮層組織中亦下降，總體趨勢(shì)與CO-Ⅰ mRNA、CO-Ⅱ mRNA變化趨勢(shì)相似，但下降程度更顯

10、著。相對(duì)于對(duì)照組，顱腦外傷后6小時(shí)傷灶周圍皮層CO-ⅢmRNA相對(duì)含量即出現(xiàn)下降（～81．89％），傷后第3天下降至最低（～12．01％）后逐漸回升，但至傷后第7天仍明顯低于對(duì)照組（～36．06％）。傷后24、72、120、168小時(shí)組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)側(cè)腦皮層組織CO-ⅡmRNA平均含量較對(duì)照組低（～85．602％），唯第5天短暫升高（～107．09％）后再次降低。各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5．結(jié)果分析

11、：顱腦外傷后短時(shí)間（6小時(shí)）內(nèi)即可觀察到傷側(cè)腦皮層出現(xiàn)線粒體DNA（mtDNA）轉(zhuǎn)錄表達(dá)下降。一般傷后第3天降至最低，后逐漸恢復(fù)，但仍明顯低于對(duì)照組。對(duì)側(cè)腦皮層組織CO-Ⅰ、CO-Ⅱ、CO-ⅢmRNA含量變化趨勢(shì)不盡相同。但都出現(xiàn)輕度升高趨勢(shì)，一般第3-5天達(dá)到峰值后降低。 結(jié)論：1．本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典顱腦外傷模型實(shí)現(xiàn)大鼠局灶性腦挫裂傷并觀察到腦挫裂傷周圍皮層細(xì)胞線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、表達(dá)存在一定的時(shí)間－含量變化規(guī)律； 2．局部

12、腦挫裂傷周圍皮層細(xì)胞線粒體基因表達(dá)傷后早期（6小時(shí)）即出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)；至第3天下降至最低后開始逐漸恢復(fù)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示傷后第7天仍明顯低于正常。 3．挫裂傷灶對(duì)側(cè)皮層細(xì)胞線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平在傷后3-5天時(shí)出現(xiàn)短暫輕度開高。除CO-ⅢmRNA相對(duì)含量均值低于正常以外，CO-Ⅰ、CO-ⅡmRNA相對(duì)含量基本保持正常水平，未直接受外力打擊，且相隔較遠(yuǎn)，但仍出現(xiàn)線粒體基因表達(dá)的改變。我們推測(cè)，局灶性腦挫裂傷后可能存在全腦病理生