APOE亞型特異性影響繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的一種疾病，其死亡率、致殘率居各類創(chuàng)傷之首。腦傷后以細(xì)胞凋亡為主要特征的繼發(fā)性腦損傷是影響傷情轉(zhuǎn)歸的主要因素。載脂蛋白E基因(apolipoprotein E，APOE)主要有ε2、ε3、ε4三個(gè)等位基因，我們前期工作和國(guó)外研究顯示，攜帶ε4的患者對(duì)腦損傷的耐受性降低，更易出現(xiàn)傷情加重及不良預(yù)后。但是，APOE影響腦損傷病情轉(zhuǎn)歸的機(jī)制尚未闡明。Ca2+超

2、載是細(xì)胞死亡的“最終共同通路”，Ca2+超載實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)外離子失衡的結(jié)果。K+是維持細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境最主要的陽(yáng)離子，目前認(rèn)為鉀通道也是細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。本課題以APOE亞型特異性與延遲整流鉀通道的關(guān)系作為切入點(diǎn)，構(gòu)建人源性ε2、ε3、ε4的真核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染APOE敲除鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells，NSCs)，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，建立神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)劃痕損傷模型，采用流式細(xì)胞技術(shù)及膜片鉗技術(shù)分析傷后AP

3、OE亞型特異性與細(xì)胞早期凋亡、延遲整流鉀通道的關(guān)系，探討APOE影響繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。 一、人源性APOE基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定人源胎腦組織中提取Total RNA后，設(shè)計(jì)引物調(diào)取APOEε3基因CDS區(qū)域，克隆至pMD19-T simple載體中并測(cè)序驗(yàn)證，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，得到APOEε2及APOEε4的重組突變體載體。EcoR I/BamHI雙酶切切下編碼APOE的片段，插入真核表達(dá)載體pEGFP-N

4、1。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞(293-T細(xì)胞)中，用熒光顯微鏡觀察基因在239一-細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果：雙酶切、PCR和質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果證明APOE各等位基因正確地克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，并能在293-T真核細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了人源性pEGFP-N1-APOE各亞型的真核表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，為下一步實(shí)驗(yàn)中各重

5、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染APOE敲除鼠的NSCs奠定了基礎(chǔ)。二、穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-N1-APOE的神經(jīng)干細(xì)胞克隆的建立和鑒定采用APOE敲除鼠(E15d)的胎鼠腦組織為細(xì)胞來(lái)源，常規(guī)分離，培養(yǎng)和鑒定所得到的NSCs。將前期構(gòu)建好的人源性APOE各等位基因重組質(zhì)粒以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至NSCs中，在含有200μg/ml G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)14d，以篩選穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)

6、胞克隆進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)以純化穩(wěn)定表達(dá)人源性APOE各等位基因的NSCs。擴(kuò)增穩(wěn)定表達(dá)目的基因的NSCs，用RT-PCR、Western Blot、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因NSCs中的表達(dá)情況。結(jié)果：成功將前期構(gòu)建的人源性APOE各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入APOE敲除鼠NSCs，經(jīng)檢測(cè)證明穩(wěn)定表達(dá)EGFP的NSCs可表達(dá)人APOE各等位基因。結(jié)論：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法可有效地將APOE各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到NSCs，經(jīng)過(guò)G418篩選后可以獲得穩(wěn)

7、定表達(dá)pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。三、APOE亞型特異性對(duì)神經(jīng)細(xì)胞傷后早期凋亡的影響本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定表達(dá)人APOE各等位基因的APOE敲除鼠NSCs，優(yōu)化誘導(dǎo)分化條件，構(gòu)建神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系?？刂茥l件，利用微量移液器槍頭切割培養(yǎng)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，造成神經(jīng)細(xì)胞機(jī)械性損傷，構(gòu)建細(xì)胞劃痕損傷模型。參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、48h)，通過(guò)Annexin V/PI聯(lián)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)損傷后各組細(xì)胞

8、早期凋亡率，分析人APOE各等位基因影響繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的差異。結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶人源性APOE各等位基因的細(xì)胞劃痕損傷模型；傷后各時(shí)間點(diǎn)均能檢測(cè)到早期凋亡細(xì)胞，24h時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞早期凋亡率較6h、12h明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)，且人APOEε4組及鼠APOE(一)組較其余組早期凋亡率明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論：轉(zhuǎn)染人APOEε4的細(xì)胞早期凋亡率高于其他組，從細(xì)胞水平為APOE多態(tài)性影響TBI病情及預(yù)

9、后的臨床研究結(jié)果提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 四、APOE亞型特異性影響神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡的機(jī)制探討以APOE亞型特異性與延遲整流鉀通道相關(guān)性作為切入點(diǎn)，采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組延遲整流鉀電流(ID)的差異。選擇邊緣清晰、大小相似的神經(jīng)元樣細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，記錄致傷前后ID情況，并進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步探討APOE影響神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡的病理機(jī)制。結(jié)果：(1)依據(jù)電生理特性證實(shí)各細(xì)胞組所記錄到的外向電流為ID。且發(fā)現(xiàn)未受傷狀態(tài)下各組神經(jīng)細(xì)胞的I