β-萘黃酮細(xì)胞特異性影響大鼠GCLC基因表達(dá).pdf

1、谷胱甘肽（GSH）是一種巰基化合物，是體內(nèi)重要的抗氧化，抗炎物質(zhì)。通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase）的催化作用清除體內(nèi)多余的氧自由基。Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是合成GSH的限速酶，其催化亞基GCLC具有全酶活性，所以致力于對(duì)GCLC基因表達(dá)調(diào)控的研究對(duì)于了解體內(nèi)GSH水平變化機(jī)制有重要意義。有報(bào)道指出β-萘黃酮（β-NF）作用人類HeG-2細(xì)胞后，可以上調(diào)GCLC基因表達(dá)水平。其機(jī)理在通

2、過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原狀態(tài)，使得抗氧化元件（ARE）與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2結(jié)合，促進(jìn)GCLC基因表達(dá)，從而促進(jìn)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)水平來(lái)促進(jìn)體內(nèi)GSH的生物合成。我們?cè)谘芯恐?，為了解能夠刺激大鼠GCLC基因表達(dá)的作用途徑，選用多種可能的刺激因子進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)β-NF作用于大鼠細(xì)胞具有獨(dú)特的特點(diǎn)，而在大鼠GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)缺少ARE元件?；谶@樣的情況，我們對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了初步分析，以探討大鼠GCLC

3、基因表達(dá)調(diào)控的特征。
　　 目的：
　　 在于研究外界刺激因子β-NF在作用濃度范圍內(nèi)對(duì)GCLC基因在大鼠RTE細(xì)胞和H4ⅡE細(xì)胞中差異性表達(dá)的影響，從而了解β-NF調(diào)控γ-GCS基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、刺激因子的篩選：將GCLC基因上游調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase報(bào)道載體與PRL-sv40海腎熒光素酶內(nèi)參表達(dá)質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染大鼠支氣管上皮細(xì)胞

4、(RTE)、大鼠肝癌細(xì)胞（H4ⅡE）細(xì)胞。待轉(zhuǎn)染12h后，將Bap，TNF-α，GSH，GSSG，Cysteamine，Cystamine，β-NF，α-NF按照所需濃度梯度刺激細(xì)胞12h，同時(shí)設(shè)定DMSO空白對(duì)照組。將每種刺激因子在不同濃度作用下的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性值與標(biāo)準(zhǔn)化空白對(duì)照組熒光素酶活性值做比較，篩選出對(duì)上述兩細(xì)胞都發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)的刺激因子及作用濃度。
　　 2、熒光定量PCR檢測(cè)：分別比較RTE細(xì)胞和H4ⅡE細(xì)胞中，

5、β-NF實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于DMSO空白對(duì)照組γ-GCS的mRNA變化倍數(shù)。
　　 3、確定刺激因子作用區(qū)間：轉(zhuǎn)染大鼠GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)r系列缺失載體，12h后添加刺激因子，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組。檢測(cè)熒光素酶活性值同上。
　　 4、作用區(qū)間內(nèi)報(bào)道載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：點(diǎn)突變NF-κB/AP-1核心元件報(bào)道載體的構(gòu)建是以GCLC-luc (-1758～+2) 為模板，按照引物導(dǎo)入核心序列突變的方法，通過(guò)兩次PCR擴(kuò)

6、增出突變-380～-375和-357～-352的NF-κB/AP-1元件的片段。2種PCR產(chǎn)物膠回收后連入pGEM-T easy載體，以Sac I/Xho I雙酶切插入PGL3-enhancer載體鑒定并測(cè)序。轉(zhuǎn)染步驟同3。
　　 5、刺激因子作用下激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的篩選：兩種細(xì)胞培養(yǎng)傳代，分別接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，12h后添加激酶抑制劑（SB-202358、kenpaullone、k-252a），設(shè)定空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染步驟同

7、3。
　　 6、免疫蛋白印跡(Western Blot)方法檢測(cè)刺激因子作用下細(xì)胞內(nèi)γ-GCS蛋白、GSK-3β蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、轉(zhuǎn)染GCLC-luc到大鼠支氣管上皮細(xì)胞(RTE)和大鼠肝癌細(xì)胞（H4ⅡE），12h后添加不同濃度梯度的各刺激因子。在兩種細(xì)胞中，β-NF（1～100uM）對(duì)GCLC基因表達(dá)均具有調(diào)控作用，而其他刺激因子在各個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)沒(méi)有影響GCLC基因的表達(dá)。在大鼠支氣管

8、上皮細(xì)胞(RTE)，β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在細(xì)胞內(nèi)螢光素酶活性水平較DMSO空白對(duì)照組分別下降了1.61、9.43、16.44倍（P＜0.01）。在大鼠肝癌細(xì)胞（H4ⅡE），β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在細(xì)胞內(nèi)螢光素酶活性水平較DMSO空白對(duì)照組上升了1.55、3.73、3.83倍（P＜0.05）。Β-NF（1～100uM）對(duì)RTE細(xì)胞GCLC基因表達(dá)有劑

9、量依賴性抑制作用，對(duì)H4ⅡE細(xì)胞GCLC基因表達(dá)有劑量依賴性上調(diào)作用。
　　 2、β-NF刺激改變細(xì)胞內(nèi)源性γ-GCS的mRNA水平，在大鼠支氣管上皮細(xì)胞(RTE)中，實(shí)驗(yàn)組γ-GCS的mRNA表達(dá)量是空白對(duì)照組的2-0.4 倍（P＜0.05）。在大鼠肝癌細(xì)胞（H4ⅡE）中，實(shí)驗(yàn)組γ-GCS的mRNA表達(dá)量是空白對(duì)照組的21.03 倍（P＜0.05）。Β-NF（10uM）在轉(zhuǎn)錄水平影響兩種細(xì)胞內(nèi)源性γ-GCS基因的表達(dá)。在RTE

10、細(xì)胞中的抑制，以及在H4ⅡE細(xì)胞中的促進(jìn)表達(dá)作用。
　　 3、將GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)r系列缺失載體分別轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞，在大鼠支氣管上皮細(xì)胞(RTE)中，轉(zhuǎn)染GCLCL-luc、5r、2r、8r、11r、12r、15a載體，處理組熒光素值較空白對(duì)照組熒光素均依次下降了7.84、15.82、12.74、11.02、16.44、10.33、12.22倍（P＜0.01），大鼠肝癌細(xì)胞（H4ⅡE）中均依次上升了1.82、

11、1.58、1.86、1.59、2.53、2.82、2.41倍（P＜0.05）。（-1780bp～-390bp）區(qū)間內(nèi)，兩種細(xì)胞處理組熒光素值與空白對(duì)照組熒光素均差異顯著。說(shuō)明β-NF在這一區(qū)間并沒(méi)有作用位點(diǎn)，從β-NF依舊影響GCLC基因的表達(dá)，可能作用位點(diǎn)在15a之后的區(qū)間即（-390bp～+2bp）。
　　 4、將構(gòu)建成功的GCLC-mut AP-1（-357～-352）–luc、GCLC-mutNF-κB（-380～-37

12、5）-luc 以及GCLC-Luc報(bào)道載體轉(zhuǎn)染RTE細(xì)胞和H4ⅡE細(xì)胞，設(shè)定β-NF處理組和DMSO空白對(duì)照組。在RTE細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染GCLC-Luc的β-NF處理組較空白對(duì)照組下調(diào)11.7倍，而GCLC-mut AP-1 –luc、GCLC-mutNF-κB-luc轉(zhuǎn)染后分別下降了15.7倍和12.7倍，下降幅度沒(méi)有減少，說(shuō)明此兩個(gè)元件與β-NF的作用無(wú)關(guān)。在H4ⅡE細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染GCLC-Luc的β-NF處理組熒光素酶值較空白對(duì)照組上調(diào)

13、3.98倍，轉(zhuǎn)染后GCLC-mut AP-1 –luc上升了2.36倍，上升幅度小于野生型（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后GCLC-mutNF-κB-luc上升了4.67倍，上升幅度沒(méi)有減少，可見(jiàn)，在H4ⅡE細(xì)胞中突變AP-1后β-NF上調(diào)GCLC基因表達(dá)能力低于對(duì)野生型的調(diào)控,β-NF影響GCLC基因的表達(dá)與AP-1作用元件有一定關(guān)系。
　　 5、在RTE細(xì)胞中，kenpaullone（2～20uM）能明顯改變?chǔ)?NF(10uM)對(duì)G

14、CLC基因表達(dá)的抑制作用，kenpaullone（2、10、20uM）+β-NF(10uM)較β-NF(10uM)的細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性有明顯的改變，分別上升了5.28、6.34、6.14倍（P＜0.01），而其他兩種激酶抑制劑則沒(méi)有發(fā)揮作用，在H4ⅡE細(xì)胞中這三種抑制劑都沒(méi)有發(fā)揮可見(jiàn)效應(yīng)。已知Kenpaullone是GSK-3β磷酸化位點(diǎn)抑制劑，可見(jiàn)在RTE細(xì)胞中，β-NF對(duì)GCLC基因表達(dá)的抑制作用是通過(guò)GSK-3β激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)