NgR特異性RNAi對EAE大鼠腦內NgR表達、小膠質細胞及髓鞘修復的影響.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化是中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)常見的自身免疫性疾病,以慢性炎性脫髓鞘為主要病理改變。在青壯年發(fā)病率相對較高,其具體的發(fā)病機制不明,缺乏有效的特異性治療,具有較高的致殘率。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究多發(fā)性硬化常用的動物模型,該模型在臨床、病理、生化等方面均能很好地模擬多發(fā)性硬化的發(fā)病過程。

2、Nogo受體(nogo receptor,NgR)是軸突再生抑制因子Nogo-A,髓鞘相關糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein,MAG),少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte MyeliN glycoprotein,OMgp)的共受體,因而在CNS損傷后軸突再生障礙中起重要作用。近來有研究表明在周圍神經損傷的動物模型中,NgR可能可引導損傷部位巨噬細胞的清除,從而起到調節(jié)炎癥的作用。此外

3、,有研究表明在多發(fā)性硬化病人的腦組織中NgR的表達是增高的。這些都提示NgR在CNS免疫性疾病中可能具有免疫調節(jié)的作用。近年來,基因沉默技術中的短鏈RNA干擾(short interfefing RNAs,siRNAs)技術可高度特異性降解目的基因,且不引起非特異性干擾反應,因而對揭示某疾病中表達異常增高的基因或蛋白的功能是非常有用。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中常駐的單核吞噬細胞之一,其在功能及形態(tài)上與巨噬細胞具有許多相似之處,參與腦內的

4、炎癥反應,并可能參與髓鞘的損傷與修復過程。因此,通過重組腺病毒為載體的NgR特異性shRNA轉染EAE大鼠腦組織,并觀察轉染前后小膠質細胞及髓鞘的情況,可有助于闡述NgR在EAE中是否具有調節(jié)小膠質細胞及髓鞘再生的作用。
　　 本研究擬探討:1在EAE動物模型中,NgR的的表達是否增高,以及小膠質細胞的數(shù)量變化及激活等情況；2以重組腺病毒為載體的NgR特異性shRNA轉染EAE大鼠的側腦室,轉染后EAE大鼠腦組織NgR基因及蛋白

5、表達的變化,以及轉染后EAE腦組織小膠質細胞的數(shù)量及激活情況的變化；3該轉染對EAE大鼠臨床發(fā)病及腦組織炎性細胞聚集、髓鞘缺失情況的影響。從而揭示NgR.在多發(fā)性硬化中可能具有的調節(jié)小膠質細胞及髓鞘再生的作用。為闡明多發(fā)性硬化等中樞神經免疫性疾病的發(fā)病機制提供理論依據(jù),并為其基因治療的臨床應用奠定基礎。
　　 方法：1.建立Wistar大鼠EAE模型,運用MRI掃描、HE染色、LuxolFast Blue染色等方法鑒定EAE模型

6、制備是否成功；通過免疫熒光染色觀察EAE腦組織中NgR表達是否上調,以及巨噬/小膠質細胞的數(shù)量是否增加及其活化情況。
　　 2.應用人胚腎293細胞擴增重組腺病毒,采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化、收集重組腺病毒,通過TCID50測定病毒滴度；用等體積的高、中、低滴度的重組腺病毒轉染EAE大鼠側腦室,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green nuorescence protein,GFP)的表達,采用HE染色觀察局部炎癥反應,從而

7、篩選出最佳的轉染滴度。
　　 3.用中滴度的Ad-shRNA-NgR、Ad-shRNA-HK分別轉染重組腺病毒載體Ad-shRNA-NgR干預組(特異性RNAi組)及重組腺病毒載體Ad-shRNA-HK干預組(陰性對照組),空白對照組以等量的PBS代替。在轉染后第7及14天取材,通過RT-PCR觀察轉染后腦組織NgRmRNA的表達,免疫熒光染色觀察轉染后腦組織NgR蛋白的表達情況以及小膠質細胞的數(shù)量變化及激活情況,行HE、Lux

8、ol Fast Blue染色以觀察炎性反應、髓鞘缺失等組織病理學變化,并對各組大鼠的臨床轉歸進行記錄。
　　 結果：1.所制備的EAE模型在MRI及病理學方面的改變符合經典EAE表現(xiàn)。EAE腦組織中NgR的表達上調,小膠質細胞數(shù)量增加,并以激活的小膠質細胞為主。
　　 2.以GFP標記了的重組腺病毒轉染293細胞后,轉染后第24～72小時,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):GFP表達逐漸增多。經擴增、純化后得重組腺病毒Ad-shRN

9、A-NgR及Ad-shRNA-Hk的滴度分別為:2.93×1010pfu/ml.2.84×1010pfu/ml。高、中、低滴度組EAE大鼠腦組織均出現(xiàn)GFP陽性表達,且高、中滴度組轉染效率明顯高于低滴度組,但高滴度組與中滴度組的GFP表達無明顯差異。HE染色顯示,高滴度組大鼠腦組織轉染局部有明顯急性炎性反應,其余組轉染局部未發(fā)現(xiàn)明顯炎性反應。
　　 3.轉染后第7天(d14):特異性RNAi組腦組織中NgR mRNA及蛋白的表達

10、明顯下降(p<0.01),小膠質細胞的表達及髓鞘缺失情況與陰性及空白對照組未見明顯差異。轉染后第14天(d21):特異性RNAi組腦組織中NgR mRNA及蛋白表達仍低于空白及陰性對照組(p<0.01),但較該組轉染后第7天時有所增加(p<0.05)；小膠質細胞的數(shù)量較空白及陰性對照組多(p<0.05),且以活化狀態(tài)為主；髓鞘缺失的恢復較空白及陰性對照組好(p<0.05)。
　　 4.與空白及陰性對照組比較,特異性RNAi組大鼠

11、的發(fā)病潛伏期延長(p<0.05)、臨床癥狀評分減輕(p<0.05)；d21時的髓鞘缺失緩解略明顯；d21時,病灶部位內的炎性細胞消退較慢。
　　 結論：EAE模型的制備是成功的。中滴度的腺病毒可高效、安全地轉染EAE腦組織。NgR特異性RNAi可明顯降低EAE腦組織中NgR基因及蛋白的表達,并有利于髓鞘缺失的修復,但對于激活的小膠質細胞的早期清除不利。該現(xiàn)象可能是通過病灶內激活的小膠質細胞啟動了髓鞘再生的修復機制,從而促進髓鞘再