NMDA受體激動(dòng)劑NMDA上調(diào)大鼠脊髓后角星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD11b的表達(dá).pdf

1、目的：研究表明，脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活在病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展和維持過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎物質(zhì)，如白介素、腫瘤壞死因子等，可以增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，提高疼痛敏感性。早期給予米諾環(huán)素，四環(huán)素類藥物等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑可以抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生，阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。但在病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其作用機(jī)制尚不完全清楚。
　　興奮性氨基酸及其受體，特別是N-甲基-D-天門冬

2、氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)及其受體在脊髓傷害性信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性氨基酸受體的一種亞型，屬于離子型受體，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。脊髓中興奮性氨基酸及其NMDA受體的異常活動(dòng)可導(dǎo)致脊髓的中樞敏化，參與自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏和痛覺超敏的形成。研究提示，NMDA受體參與神經(jīng)病理性疼痛模型中脊髓后角膠質(zhì)細(xì)胞的激活。但外周炎性痛過(guò)程中脊髓后角膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制尚不

3、清楚。我室既往應(yīng)用免疫印跡分析技術(shù)和免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，給大鼠足底注射蜜蜂毒使大鼠發(fā)生傷害性感受的同時(shí)，脊髓后角星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein，GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b/c(OX-42)蛋白表達(dá)增加。預(yù)先椎管內(nèi)注射NMDA受體阻斷劑MK-801可以抑制蜜蜂毒引起的GFAP和CD11b表達(dá)的上調(diào)。這些結(jié)果初步提示NMDA受體的激活是介導(dǎo)炎性痛及痛過(guò)敏過(guò)程中脊髓后

4、角星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的原因之一。
　　本課題在此基礎(chǔ)上，采用免疫印跡分析(western blot)技術(shù)，進(jìn)一步觀察大鼠鞘內(nèi)注射NMDA受體特異性激動(dòng)劑NMDA對(duì)GFAP和CD11b兩種蛋白表達(dá)的影響，為闡明NMDA受體激活在傷害性信息傳入引起的脊髓后角膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：雄性Sprague-Dawley大鼠120只，體重210-220 g，隨機(jī)分為以下各組：
　?、賡ham

5、組：椎管內(nèi)注射生理鹽水10μl。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材觀察。
　?、贜MDA時(shí)間依賴組：鞘內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10 nmol)分別于椎管內(nèi)注射后1h、4h、8h、12 h、1d、2d、3d取材，觀察腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達(dá)的時(shí)間特點(diǎn)。取材之前測(cè)定機(jī)械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對(duì)比分析GFAP和CD11b的表達(dá)與痛覺過(guò)敏的時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　?、跱MDA劑量依賴組：鞘內(nèi)注射NMDA溶液1

6、0μl。根據(jù)NMDA的注射劑量，進(jìn)一步分為0.1 nmol、1 nmol和10 nmol三個(gè)亞組。各組動(dòng)物在鞘內(nèi)注射之后8h取材，觀察NMDA上調(diào)大鼠腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達(dá)的劑量依賴性。取材之前測(cè)定機(jī)械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對(duì)比分析GFAP和CD11b的表達(dá)與痛覺過(guò)敏的劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　?、躆K-801+NMDA組：首先鞘內(nèi)注射NMDA受體抑制劑MK-801生理鹽水溶液10μl(50

7、nmol)，15 min后鞘內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10nmol)。在注射NMDA之后8h取材，觀察MK-801對(duì)NMDA引起的腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達(dá)上調(diào)的影響。取材之前測(cè)定機(jī)械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對(duì)比分析預(yù)先給予MK-801大鼠GFAP和CD11b的表達(dá)與痛覺過(guò)敏的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　　以上各組動(dòng)物在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)取材，應(yīng)用western blot方法測(cè)定其脊髓后角GFAP和CD11b的

8、表達(dá)，以反映脊髓后角星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。每組10只大鼠，其中5只用于GFAP的測(cè)定，5只用于CD11b的測(cè)定。
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(StatisticalProgram for Social Sciences13.0)進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA)，比較組間差異，有顯著差異者用最小顯著差法(least significantdifference)進(jìn)行兩兩比較，

9、以p＜0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1痛行為反應(yīng)
　　1.1自發(fā)痛行為反應(yīng)椎管內(nèi)注射NMDA以后大鼠出現(xiàn)了特征性的傷害性行為反應(yīng)，包括一些緊張性的咬、抓、舔、吱叫和扭體等。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種痛行為反應(yīng)逐漸消失。預(yù)先給予NMDA受體抑制劑MK-801可以減輕大鼠出現(xiàn)的上述反應(yīng)。
　　1.2機(jī)械縮足反射閾值大鼠椎管內(nèi)注射NMDA10 nmol以后4h，大鼠的機(jī)械縮足反射閡值開始出現(xiàn)降低(P＜0

10、.05)，并持續(xù)到給予NMDA后1d，2d時(shí)逐漸恢復(fù)至sham組水平，表明椎管內(nèi)注射NMDA后早期就已經(jīng)出現(xiàn)機(jī)械痛覺過(guò)敏，而且這種痛覺過(guò)敏可持續(xù)一定的時(shí)間。上述椎管內(nèi)注射NMDA引起的痛覺過(guò)敏呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著NMDA劑量的增大，機(jī)械縮足反射閾值逐漸減小。鞘內(nèi)預(yù)先給予MK-801可以在一定程度上阻斷NMDA引起的機(jī)械縮足反射閾值的減小。
　　1.3熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期大鼠椎管內(nèi)注射NMDA10 nmol以后1h，

11、大鼠的熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期開始縮短(P＜0.05)，并持續(xù)到椎管內(nèi)給予NMDA后12 d，1d時(shí)逐漸恢復(fù)至sham水平，表明椎管內(nèi)注射NMDA后早期就已經(jīng)出現(xiàn)熱痛覺過(guò)敏，而且這種熱痛覺過(guò)敏可持續(xù)一定的時(shí)間。上述椎管內(nèi)注射NMDA引起的痛覺過(guò)敏呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著NMDA注射劑量的增大，熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期逐漸縮短。鞘內(nèi)預(yù)先給予MK-801可以在一定程度上阻斷NMDA引起的熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期的縮短。
　　2

12、脊髓后角GFAP的表達(dá)椎管內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10 nmol)后1h，脊髓后角GFAP的表達(dá)與sham組相比開始增加(P＜0.05)，8h達(dá)到高峰，隨后逐漸下調(diào)，至3d時(shí)基本恢復(fù)到sham組水平。上述GFAP表達(dá)上調(diào)的時(shí)間過(guò)程與椎管內(nèi)注射NMDA后痛行為表現(xiàn)的時(shí)間特征基本一致。隨著大鼠椎管內(nèi)給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10nmol)，脊髓后角GFAP的表達(dá)也逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預(yù)先椎管內(nèi)

13、給予NMDA受體阻滯劑MK-801可明顯抑制上述NMDA引起的GFAP表達(dá)的上調(diào)(P＜0.05)。
　　3脊髓后角CD11b的表達(dá)與sham組相比，大鼠椎管內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10 nmol)后1 h，脊髓后角CD11b的表達(dá)開始上調(diào)(P＜0.05)，4h逐漸增多，至8h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量逐漸下調(diào)，至3d時(shí)基本恢復(fù)到sham組水平。隨著大鼠椎管內(nèi)給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10 nmol)，脊

14、髓后角CD11b的表達(dá)也逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預(yù)先椎管內(nèi)給予NMDA受體阻滯劑MK-801可明顯抑制上述NMDA引起的CD11b表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1大鼠椎管內(nèi)注射NMDA受體特異性激動(dòng)劑NMDA可以劑量依賴性地上調(diào)脊髓后角GFAP和CD11b蛋白的表達(dá)，GFAP和CD11b表達(dá)上調(diào)的時(shí)間特點(diǎn)與椎管內(nèi)注射NMDA引起的痛行為反應(yīng)時(shí)間特點(diǎn)基本一致。
　　2 NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑