水稻細(xì)胞膜上非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體的研究.pdf

1、第一部分、水稻細(xì)胞膜上非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體的研究
　　 非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Nonspecific lipid transfer protein，nsLTP)是植物體內(nèi)一類小分子量的堿性蛋白質(zhì)。三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由四個(gè)α-螺旋組成，四個(gè)α-螺旋由四對(duì)二硫鍵相連，形成一個(gè)能結(jié)合各種脂質(zhì)分子的疏水性孔穴。已有報(bào)道認(rèn)為NsLTP參與了植物系統(tǒng)獲得性抗性信號(hào)的傳導(dǎo)，介導(dǎo)花粉黏附在柱頭上并引導(dǎo)花粉管的伸長(zhǎng)，推測(cè)它可能在細(xì)胞膜上存在受體。利

2、用綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作為標(biāo)記，研究了水稻nsLTP144在擬南芥中的定位，nsLTP144主要定位在細(xì)胞壁中，還有一部分和細(xì)胞膜相連，綠色熒光在細(xì)胞膜上呈不均勻分布；為了進(jìn)一步研究nsLTP同細(xì)胞膜的連接，是否是nsLTP與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)以配體一受體方式作用的結(jié)果，我們采用放射性免疫結(jié)合分析法，利用放射性碘-125標(biāo)記原核表達(dá)的兩種nsLTP：Trx-nsLTP144、Trx-n

3、sLTP110，再將其與水稻細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)125Ⅰ-Trx-nsLTP144、125Ⅰ-Trx-nsLTP110與水稻細(xì)胞質(zhì)膜均具有特異性結(jié)合，而且結(jié)合是飽和性的、可被競(jìng)爭(zhēng)的，符合配體-受體結(jié)合的典型特征，同時(shí)用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)125Ⅰ-Thioredoxin沒有此特性，表明水稻細(xì)胞質(zhì)膜上存在nsLTP的受體；利用可氧化糖基的NaIO4和水解糖基的N’-糖苷酶F處理水稻細(xì)胞質(zhì)膜，再進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)合活性幾乎不受影響；而利用

4、胰蛋白酶處理細(xì)胞膜則使得結(jié)合能力幾乎完全喪失，表明其受體為沒有經(jīng)過糖基化修飾的蛋白質(zhì)；利用交聯(lián)劑BS3交聯(lián)配體-受體后，再進(jìn)行SDS-PAGE分離和放射自顯影，結(jié)果顯示水稻細(xì)胞質(zhì)膜上的nsLTP受體中有一個(gè)60kDa的蛋白質(zhì)可以與nsLTP144發(fā)生特異性的結(jié)合，可能是其受體；細(xì)胞外堿化實(shí)驗(yàn)表明，nsLTP144不能促使擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞外堿化反應(yīng)，卻能猝滅來自植物病原菌的激發(fā)子Cryptogein刺激擬南芥原生質(zhì)體產(chǎn)生的細(xì)

5、胞外堿化反應(yīng)，表明nsLTP和Cryptogein結(jié)合細(xì)胞膜上相同的位點(diǎn)，保護(hù)了植物細(xì)胞免受Cryptogein導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡，并誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性的產(chǎn)生；體外Pull-down實(shí)驗(yàn)表明，nsLTP144和水稻的OsCaM1具有相互作用，暗示了nsLTP144和OsCaM1可能同在一個(gè)信號(hào)通路上起作用。這些研究豐富了人們對(duì)nsLTP基因功能的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步克隆其受體基因并最終闡明nsLTP介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ)。