水稻非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的功能與結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文水稻非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的功能與結(jié)構(gòu)研究姓名：葛曉春申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：孫崇榮2001.11.10水m#特異性脂質(zhì)’#穆_白的自能與培構(gòu)日究此外，還研究了LTPIl0和LTPl44在不同環(huán)境條件下的表達(dá)。由于SA是植物抗病反應(yīng)中的信號(hào)分子之一，利用SA處理水稻茁，觀察它們的表達(dá)變化，LTPl44的表達(dá)幾乎不受SA的影響，￡7a10在第3天后受到輕微抑制，Northern結(jié)果表明它們不是sA信號(hào)途徑

2、的下游基因，僅僅受到一些旁側(cè)影響；當(dāng)水稻苗受到熱、高鹽及甘露糖醇的脅迫時(shí)，LTPll0及LTPl44的表達(dá)水平均有所上升，暗示它們與水稻抗逆相關(guān)，可能參與了角質(zhì)合成；受到冷脅迫時(shí)，它們的表達(dá)水平均下降，表明受寒冷的抑制。由于大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物缺少翻譯后加工，為了與表達(dá)產(chǎn)物的功能研究相對(duì)照，還摸索了從水稻黃化苗中抽提nsLTP的方法，結(jié)果表明水稻苗中提取的nsLTP亦具有抑菌活性，抗性水平接近大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物。NsLTP的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是

3、目前還不清楚的問(wèn)題。為什么結(jié)構(gòu)非常相似的蛋白有的具有抗性，而有的卻不表現(xiàn)任何抗性，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)究竟是什么，這是我們感興趣的問(wèn)題。為此，我們參考已解析出的nsLTP的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并比較不同來(lái)源的nsLTP的一級(jí)順序，選擇了LTPllO中幾個(gè)結(jié)構(gòu)上重要且較為保守的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，并對(duì)突變體進(jìn)行了表達(dá)和純化。由于nsLTP在Impact—CN系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)量較低，我們換用了硫氧還蛋白表達(dá)載體來(lái)表達(dá)突變體蛋白，比較了它們?cè)趦煞N硫氧還蛋白表達(dá)載體中

4、的表達(dá)，最后選擇了pET32a()來(lái)表達(dá)及純化野生型和所有突變體蛋白。脂質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有的突變體均具有脂質(zhì)結(jié)合活性，CD譜掃描發(fā)現(xiàn)D45A、P72L的二級(jí)結(jié)構(gòu)與野生型較為接近，而Y17A、C50A和R46A的二級(jí)結(jié)構(gòu)中a一螺旋明顯減少，無(wú)規(guī)卷曲增多，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯破壞，隨后的抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)D45A和C50A仍有明顯抗性，與野生型接近，而其它所有突變體均不表現(xiàn)抑制活性，表明功能受到破壞。綜合這些結(jié)果，我們得出結(jié)論：分子內(nèi)Tyrl7對(duì)