利用RNAi技術(shù)研究人胚胎干細(xì)胞特異性表達新基因HESRG功能.pdf

1、本研究擬在上述研究基礎(chǔ)上,進一步利用化學(xué)合成siRNA、慢病毒RNAi載體和可誘導(dǎo)RNAi技術(shù)等多種手段全面研究人ES細(xì)胞中HESRG的功能。[檢測HESRG特異性表達及其亞細(xì)胞定位]
　　 通過RT-PCR檢測在小鼠ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞的HESRG mRNA水平表達,結(jié)果顯示只在人ES細(xì)胞檢測到HESRG,在小鼠ES細(xì)胞未檢測到HESRG表達。
　　 通過生物信息學(xué)方法(JW方法)篩選找到HESRG蛋白抗原表位,合成特

2、異性多肽,然后將其C末端氨基酸偶聯(lián)匙孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin,KLH),免疫新西蘭大白兔,每只均經(jīng)過四次免疫,采集兔免疫血清,親和層析純化,酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定抗體效價,由此制備了HESRG特異性抗體。隨后,我們利用HESRG抗體采用間接免疫熒光檢測HESRG在小鼠ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞的表達,結(jié)果顯示在小鼠ES細(xì)胞未檢測

3、到HESRG蛋白表達,在人ES細(xì)胞檢測到表達,熒光信號定位于細(xì)胞核,結(jié)合實驗室前期對HESRG的表達分析,進一步證實HESRG是人ES細(xì)胞特異性表達基因,可能作為轉(zhuǎn)錄因子起作用。[利用化學(xué)合成siRNA人ES細(xì)胞特異性表達基因]
　　 化學(xué)合成針對HESRG的siRNA,轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞,通過相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。轉(zhuǎn)染24小時,人ES細(xì)胞變得分散、扁平,開始分化；轉(zhuǎn)染48小時細(xì)胞分散、細(xì)長,出現(xiàn)絲狀物,似神經(jīng)前體細(xì)胞表

4、型；轉(zhuǎn)染72小時,細(xì)長、絲狀物更加明顯,細(xì)胞形態(tài)仍似神經(jīng)前體細(xì)胞表型,但是部分細(xì)胞開始死亡。收集細(xì)胞,抽提RNA,通過RT-PCR在mRNA水平檢測HESRG基因、人ES細(xì)胞多潛能標(biāo)志基因(Oct4、Nanog)、神經(jīng)外胚層標(biāo)志基因(Nestin、Musashi1、FGF5、Sox1)、中胚層標(biāo)志基因(BRACHYURY(T)、Hand1)、內(nèi)胚層標(biāo)志基因(GATA6、AFP)、滋養(yǎng)外胚層標(biāo)志基因(CGα),檢測結(jié)果顯示抑制HESRG表

5、達以后人ES細(xì)胞多潛能性標(biāo)志基因Oct4、Nanog表達均出現(xiàn)顯著下調(diào)；而神經(jīng)外胚層分化標(biāo)志基因Nestin表達顯著出現(xiàn)上調(diào)、Musashi1表達上調(diào),未檢測到其它胚層標(biāo)志基因表達。
　　 隨后,我們采用間接免疫熒光方法蛋白質(zhì)水平檢測HESRG、多潛能性標(biāo)志分子Oct4及各胚層分化標(biāo)志分子(Nestin、Musashi1、Hand1、GATA6、CGα)的表達情況,檢測結(jié)果顯示HESRG、Oct4表達在干擾后的細(xì)胞中顯著下調(diào),而

6、神經(jīng)外胚層標(biāo)志分子Nestin的表達顯著升高,Musashi1表達水平升高。我們的實驗結(jié)果從細(xì)胞形態(tài)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平三方面證明在HESRG基因表達被顯著抑制后,人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,表明HESRG可能抑制人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,參與人ES細(xì)胞自我更新。[利用慢病毒干擾載體研究HESRG基因功能]
　　 首先構(gòu)建HESRG基因的慢病毒干擾載體:將siRNA insert(shHESRG)插入慢病毒shRNA表達載體p

7、RNATin-H1.4/Lenti中,通過電泳酶切和測序鑒定,shHESRG慢病毒表達載體構(gòu)建正確,命名為pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG。該載體的啟動子是包含兩個TetO元件的H1.4啟動子。當(dāng)不存在其反式調(diào)控因子四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)時,H1.4啟動子可以像常規(guī)的H1啟動子一樣啟動shRNA的表達,進而下調(diào)目的基因的表達。
　　 為了獲得較高的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞的效率,我們首先采用了受EF1α啟

8、動子(該啟動子在人ES細(xì)胞中具有較強的活性)調(diào)控的報告基因(增強型綠色熒光蛋白基因,EGFP)的慢病毒表達載體(pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W)來摸索慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞的合適條件。采用陽離子脂質(zhì)體法進行病毒包裝,將pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W10μg、pMD2.G5μg、psPAX27.5μg共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,72小時后收集病毒上清,3000rpm離心15分鐘去除細(xì)胞碎片,超速離心濃

9、縮病毒上清。將濃縮后的病毒顆粒感染人ES細(xì)胞,72小時左右可觀察到綠色熒光信號,感染效率與克隆的大小有一定關(guān)系,成功感染pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W的人ES細(xì)胞綠色熒光信號并沒有隨著傳代而消失,表明慢病毒顆粒攜帶EGFP表達穩(wěn)定持久。
　　 采用同樣的方法進行pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG包裝和感染人ES細(xì)胞。感染病毒顆粒的第五天左右可以觀察到人ES細(xì)胞變得分散、細(xì)長,似神經(jīng)前體細(xì)胞形

10、態(tài)。收集細(xì)胞,提取RNA,通過realtime-PCR檢測mRNA水平上HESRG基因、多潛能標(biāo)志基因及各胚層標(biāo)志基因的表達改變。間接免疫熒光檢測檢測HESRG、多潛能性標(biāo)志分子Oct4及各胚層分化標(biāo)志分子(Nestin、Musashi1、GATA4、Hind1、CGα)表達情況。Realtime-PCR和間接免疫熒光結(jié)果與瞬時轉(zhuǎn)染siHESRG結(jié)果一致。[可誘導(dǎo)RNAi方法研究HESRG基因功能]
　　 四環(huán)素(tetracy

11、cline)誘導(dǎo)的基因表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物細(xì)胞誘導(dǎo)表達系統(tǒng),該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效、可控制性強的優(yōu)點。該系統(tǒng)可分為“Tet-off”和“Tet-on”系統(tǒng),其中“Tet-on”系統(tǒng)由于誘導(dǎo)的可控性更強而應(yīng)用更廣泛?！癟et-on”系統(tǒng)可受到四環(huán)素衍生物強力霉素(doxycycline,Dox)嚴(yán)格調(diào)控,由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成,調(diào)節(jié)質(zhì)?？杀磉_TetR阻遏物,而反應(yīng)質(zhì)粒包含四環(huán)素反應(yīng)元件(Tet responsive elem

12、ent,TRE),如TetO。在沒有Dox存在的情況下,tetR可以與TRE結(jié)合,抑制啟動子活性,關(guān)閉下游目的基因或shRNA的表達；而加入Dox后,Dox可以與TetR阻遏物結(jié)合,使之不能與TRE結(jié)合,從而使下游目的基因或shRNA高效表達。已有研究報道表明“Tet-on”可誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠有效地應(yīng)用在人ES細(xì)胞中。鑒于HESRG表達被干擾后導(dǎo)致人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層細(xì)胞分化,我們擬進一步利用“Tet-on”系統(tǒng)在人ES細(xì)胞中建立一個可誘

13、導(dǎo)的HESRG特異性的shRNA表達系統(tǒng),然后再精密調(diào)控HESRG表達水平,以詳細(xì)研究HESRG在細(xì)胞自我更新和分化中的作用。
　　 首先建立表達TetR的人ES細(xì)胞系。通過轉(zhuǎn)染TetR表達質(zhì)粒(pCAG-TetRnls)于H9人胚胎干細(xì)胞系,加入puromycin(2μg/ml)進行篩選得到抗性克隆。采用RT-PCR檢測TetR mRNA表達水平,Western Blot檢測TetR蛋白表達水平；從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面未分化抗原

14、(TRA-1-60、SSEA-3)、多潛能標(biāo)志物、堿性磷酸酶(AKP)、細(xì)胞分化潛能(體外實驗)對TetR表達水平最高的人ES細(xì)胞克隆進行鑒定。結(jié)果顯示,我們獲得了高表達TetR的人ES細(xì)胞系并命名為H9-TetR,H9-TetR和H9細(xì)胞系一樣具有多潛能分化和自我更新特性,可以用于進一步實驗。穩(wěn)定表達TetR的人ES細(xì)胞系構(gòu)建成功,為在人ES細(xì)胞建立可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。
　　 如前所述,pRNATin-H1.4/Lent

15、i-shHESRG載體的inH1.4啟動子包含TetO元件。當(dāng)存在TetR阻遏物時,TetR可以與TetO元件結(jié)合,抑制H1啟動子活性,從而關(guān)閉shRNA表達,而四環(huán)素或四環(huán)素衍生物Dox則能與TetR結(jié)合并去除TetR對H1啟動子的抑制,從而啟動shRNAs的表達。將濃縮的pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG病毒顆粒感染H9-TetR細(xì)胞。與前面轉(zhuǎn)染空白H9細(xì)胞導(dǎo)致其發(fā)生分化的情況不同,轉(zhuǎn)染的H9-TetR細(xì)胞形態(tài)未發(fā)

16、生變化,仍呈緊密、克隆狀生長。加入G418篩選,挑克隆擴大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆,命名為H9-TetR-shHESRG細(xì)胞。然后,加入Dox(1μg/ml濃度)誘導(dǎo)H9-TetR-shHESRG細(xì)胞中HESRG shRNA的表達,48小時后,細(xì)胞變得分散、細(xì)長,開始分化；而未加Dox誘導(dǎo)的H9-TetR-shHESRG細(xì)胞仍呈緊密克隆狀生長,說明我們己初步在人ES細(xì)胞建立了可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng)。
　　 綜上所述,本研究從mRNA和蛋

17、白質(zhì)水平檢測到HESRG在人ES細(xì)胞特異表達,其蛋白表達定位于細(xì)胞核。利用化學(xué)合成siRNA、慢病毒shRNA表達載體和可誘導(dǎo)shRNA系統(tǒng)等三種RNAi技術(shù)手段成功地抑制了HESRG表達,且均觀察到HESRG表達下調(diào)可導(dǎo)致人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,表明HESRG新基因可以通過抑制神經(jīng)外胚層分化維持人ES細(xì)胞自我更新。此外,我們已初步在人ES細(xì)胞中建立了HESRG新基因的可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng),為進一步深入研究該新基因在人ES細(xì)胞中起作用的分