小鼠精原干細(xì)胞新特異性標(biāo)記物的確定.pdf

1、目的：近年來(lái)男性不育率呈逐年上升趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示全世界不孕不育癥患病率約為10％-15%，其中因?yàn)槟行圆挥蛩氐谋壤呀?jīng)占到了一半。人類(lèi)精液的質(zhì)量和精子數(shù)量下降是造成男性不育的最主要原因。目前，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，環(huán)境污染、遺傳、毒物、藥物等多種因素的不斷作用，地球稀有物種數(shù)量不斷減少、滅絕，雄性動(dòng)物生殖能力不斷下降，最新研究證實(shí)，各種化學(xué)污染正讓包括人類(lèi)的雄性動(dòng)物雌性化，損害雄性生殖器官和生殖力，雄性已演化成為弱

2、勢(shì)族群，岌岌可危，勢(shì)必對(duì)人類(lèi)和野生動(dòng)植物帶來(lái)難以估量的后果。世界衛(wèi)生組織預(yù)言男性不育癥、癌癥、心血管疾病將成為21世紀(jì)危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的三大疾病。精子深低溫凍存是唯一一種通過(guò)生殖扶育手段維持男性生育能力的方法，包括卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)和圓形精子注射技術(shù)。但其成功率特別低，僅達(dá)到25%左右。在無(wú)精癥患者中，非梗阻性無(wú)精癥患者占到60%，對(duì)于成熟精子的獲取顯得異常困難。為此如何保護(hù)雄性動(dòng)物包括人類(lèi)在內(nèi)的的生殖能力成了擺在當(dāng)今科學(xué)界面前的

3、重要任務(wù)、精原干細(xì)胞移植技術(shù)就是在這樣的一個(gè)大背景下誕生的具有前沿性的生命技術(shù)，該技術(shù)是從適齡雄性供體動(dòng)物采集精原干細(xì)胞，注射入適齡受體動(dòng)物的生精小管中使其產(chǎn)生精子的技術(shù)。隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷深入研究,精原干細(xì)胞不但可以在同種間進(jìn)行移植,而且在異種間的移植也獲得成功。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)體系的不斷完善，篩選、移植方法的不斷改進(jìn),可以獲得更高的移植成功率。精原干細(xì)胞移植技術(shù)應(yīng)用的前提是利用特異性的標(biāo)志物在眾多細(xì)胞中快速高效的提取目的干細(xì)胞，并將其移入

4、到受體組織中。精原干細(xì)胞移植為提高優(yōu)良品種家畜的生產(chǎn)效率、保護(hù)野生動(dòng)物資源、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)及不育癥的治療提供了一種新的方法。目前國(guó)際、國(guó)內(nèi)已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的精原干細(xì)胞標(biāo)志物多達(dá)10余個(gè)，但均缺乏特異性。本研究就是為了尋找更好的精原干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物并觀察其在各年齡階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　方法：前期利用iTRAQ蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)觀測(cè)各年齡階段精原干細(xì)胞蛋白標(biāo)志物表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，運(yùn)用生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物（P63

5、、CD71、CD98、ALDH2、E-cadherin、PLZF）。依據(jù)在出生后6天小鼠睪丸內(nèi)性原細(xì)胞發(fā)育為精原干細(xì)胞，以正常雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，按照年齡段不同隨機(jī)分組如下：出生1-6天、出生7-14天、出生15-21天、出生22-28天、出生29-35天、出生36-42天、出生43-49天、出生50天以上（共8組），每組6只。首先免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)以上蛋白在小鼠各年齡段的睪丸中的表達(dá)情況，若蛋白在睪丸中的表達(dá)具有特

6、異性，用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)新標(biāo)記物的表達(dá)位置，采用已知的SSCs標(biāo)記物（CD90）做對(duì)照，用新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物在小鼠的各個(gè)階段進(jìn)行免疫組織熒光雙標(biāo)，來(lái)定位新標(biāo)記物是否在SSCs表達(dá)。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)新標(biāo)記物在小鼠各階段基因水平的表達(dá)量，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（western blot）檢測(cè)新標(biāo)記物在小鼠的各個(gè)階段蛋白水平的表達(dá)量。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，P63蛋白在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的

7、陽(yáng)性表達(dá)；E-cadherin蛋白在各年齡段小鼠睪丸中基底膜處細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，且在生精小管其他位置也有陽(yáng)性表達(dá)；CD98蛋白在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的陽(yáng)性表達(dá)；CD71蛋白同樣在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的陽(yáng)性表達(dá)；ALDH2蛋白不在小鼠各年齡段細(xì)胞上表達(dá)，在小鼠間質(zhì)細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)。這5個(gè)蛋白表達(dá)沒(méi)有特異性。PLZF蛋白在小鼠各年齡段表達(dá)且具有細(xì)胞特異性。
　　結(jié)論：P63