大鼠精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)、鑒定及其特異標(biāo)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、在雄性哺乳動(dòng)物睪丸內(nèi)持續(xù)的精子發(fā)生是維持其生殖能力的必備條件。精原干細(xì)胞(SpermatogonialStemCells，SSCs)是精子發(fā)生的基礎(chǔ)，既可以逐級(jí)分化最終產(chǎn)生有功能的成熟精子，又可以自我更新維持其干細(xì)胞的數(shù)量。體外對(duì)SSCs進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)及其它操作技術(shù)的建立為精子發(fā)生過(guò)程、雄性輔助生殖、細(xì)胞再生治療和遺傳學(xué)的研究開(kāi)辟了新的道路。鑒于SSCs具有多種潛能和應(yīng)用前景，極具研究?jī)r(jià)值，本研究對(duì)大鼠SSCs進(jìn)行了系統(tǒng)且完整的分離

2、純化、長(zhǎng)期培養(yǎng)以及體外分化能力的研究。之所以選擇大鼠為研究對(duì)象是因?yàn)榇笫笞鳛槟Ｊ絼?dòng)物，能為哺乳動(dòng)物SSCs的特性和機(jī)理研究提供更多便利和資料。此外，大鼠還具有其他優(yōu)勢(shì)，如大小、繁殖力、易于手術(shù)處理、取樣方便和便于實(shí)驗(yàn)管理等，使其成為特別有吸引力的動(dòng)物模型，將為人類(lèi)健康和疾病的研究提供更多的生理及臨床研究數(shù)據(jù)。此外，構(gòu)建可在睪丸SSCs中特異表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒載體，將能夠很方便地辨認(rèn)SSCs，使得SSCs在體內(nèi)外關(guān)于增殖和分化的動(dòng)態(tài)變

3、化直觀地表現(xiàn)出來(lái)，這將大大便利于SSCs的特性和功能的研究。為此，本研究制備了在睪丸SSCs中特異表達(dá)紅色熒光蛋白的質(zhì)粒載體，若能聯(lián)合精原干細(xì)胞移植技術(shù)，制備轉(zhuǎn)基因大鼠，預(yù)計(jì)該轉(zhuǎn)基因大鼠將在SSCs中特異表達(dá)紅色熒光蛋白，為后續(xù)SSCs體內(nèi)外的研究提供實(shí)用的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。
　　 1.大鼠精原干細(xì)胞的分離和純化
　　 本研究以22-25天Wistar-Iamichi大鼠為研究對(duì)象，利用兩步酶消化法分離得到睪丸曲細(xì)精管

4、細(xì)胞懸液，根據(jù)精原干細(xì)胞與曲細(xì)精管細(xì)胞懸液中體細(xì)胞(支持細(xì)胞及少量的管周細(xì)胞)及各級(jí)分化的生精細(xì)胞貼壁能力及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)粘附力的不同，將大鼠精原干細(xì)胞進(jìn)行純化。經(jīng)純化后5只大鼠的睪丸約可以得到3×105個(gè)SSCs。利用該方法分離和純化大鼠SSCs，操作簡(jiǎn)便，且得到的SSCs具有很高的活力和增殖能力，是一種高效的分離純化方法。
　　 2.大鼠精原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)
　　 本研究建立了大鼠SSCs體外長(zhǎng)期培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)以

5、絲裂霉素處理的STO(SIMmouseembryo-derivedthioguanineandouabainresistant)細(xì)胞為滋養(yǎng)層，使用無(wú)血清、培養(yǎng)成分明確的培養(yǎng)液，添加GDNF(basicfibroblastgrowthfactor)，bFGF(glialcellline-derivedneurotrophicfactor)，GFRα1(GDNF-familyreceptorα1)三個(gè)重要生長(zhǎng)因子。在該培養(yǎng)體系中，大鼠SSC

6、s連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)6個(gè)月，傳代超過(guò)30代，葡萄串狀的SSCs細(xì)胞克隆形態(tài)保持不變。該SSCs可在體外任意培養(yǎng)時(shí)期進(jìn)行冷凍保存，解凍后可迅速恢復(fù)生長(zhǎng)。該體系的穩(wěn)定建立，為日后大鼠SSCs的研究和應(yīng)用奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 3.體外長(zhǎng)期培養(yǎng)大鼠精原干細(xì)胞的鑒定
　　 本研究運(yùn)用睪丸冰凍切片免疫熒光染色和曲細(xì)精管整段免疫熒光染色對(duì)大鼠睪丸內(nèi)SSCs的位置分布及形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，并證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)記基因CDH1，GFRαl，PLZF是

7、可靠的大鼠SSCs的標(biāo)記基因。對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的大鼠SSCs進(jìn)行分子水平的鑒定。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光分析可見(jiàn)，培養(yǎng)的大鼠SSCs同時(shí)表達(dá)CDH1，GFRα1和PLZF三個(gè)SSCs標(biāo)記基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RT-PCR分析證實(shí)了CDH1，GFRα1，PLZF在長(zhǎng)期培養(yǎng)的大鼠SSCs中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)還證實(shí)了其他SSCs標(biāo)記基因c-kit，POU5f1，C-Ret的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。該鑒定技術(shù)簡(jiǎn)便、可靠，可用來(lái)鑒定體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的SSCs，為日后SSCs的后續(xù)研究奠定

8、了基礎(chǔ)，并為家畜等大動(dòng)物SSCs體外鑒定提供了借鑒。
　　 4.大鼠精原干細(xì)胞體外分化功能的鑒定
　　 在該體系中，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的大鼠精原干細(xì)胞與睪丸體細(xì)胞共培養(yǎng)，采用MEMα+10％FBS培養(yǎng)液，并添加促卵泡激素(FSH)和睪酮，在34℃，5%CO2和飽和濕度條件下進(jìn)行體外分化培養(yǎng)。該培養(yǎng)體系在開(kāi)始培養(yǎng)的24h之內(nèi)，精原細(xì)胞大量死亡，之后逐漸穩(wěn)定，培養(yǎng)兩周左右的時(shí)間可以觀察到精母細(xì)胞，培養(yǎng)三周后可觀察到體積較小的精子細(xì)

9、胞。該研究證實(shí)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的大鼠SSCs是有生理功能的，同時(shí)該體系的建立也為在體外深入進(jìn)行大鼠精子發(fā)生研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.SSCs特異標(biāo)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 該載體采用CDH1啟動(dòng)子。CDH1已經(jīng)被證實(shí)是小鼠和大鼠SSCs的標(biāo)記分子。本研究采用無(wú)啟動(dòng)子的基礎(chǔ)載體pDsRed2-1，在其多克隆位點(diǎn)插入CDH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白基因DsRed2的表達(dá)，在其相反方向插入了CMV-EGFP基因表達(dá)框，期待轉(zhuǎn)染細(xì)