利用轉(zhuǎn)基因方法研究人胚胎干細(xì)胞特異性表達(dá)新基因HESRG的亞細(xì)胞定位和功能.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是從植入前早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或原始生殖細(xì)胞(PGCs)中分離得到并能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的高度未分化的全能細(xì)胞系。在體外特定的、適宜的培養(yǎng)體系中，人ES細(xì)胞可長(zhǎng)期無限增殖，同時(shí)仍保持不分化狀態(tài)和多向分化潛能。在體外可以誘導(dǎo)其分化成特定組織的成熟細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞和造血細(xì)胞等，成為神經(jīng)退行性疾病、心肌梗塞、糖尿病和血液病等疾病細(xì)胞移植治療的一個(gè)重要細(xì)胞來源。人ES細(xì)胞系首先是由Thomson等和

2、Shamblott等于1998年分別從ICM和PGCs建立。人ES細(xì)胞一經(jīng)建立便立即成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具吸引力的熱點(diǎn)。 人ES細(xì)胞體外培養(yǎng)條件比較苛刻，條件不宜時(shí)容易自發(fā)分化。人ES細(xì)胞體外培養(yǎng)方式可分為有飼養(yǎng)層培養(yǎng)和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)即將人ES細(xì)胞培養(yǎng)在鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)上，然而該培養(yǎng)方式易引起鼠源性蛋白的污染而給人ES細(xì)胞的臨床運(yùn)用帶來困擾。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)則是使用源于MEFs并添加了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b

3、FGF)的條件培養(yǎng)基(CM培基)進(jìn)行培養(yǎng)，其操作較繁瑣，費(fèi)用較高，不適于大規(guī)模培養(yǎng)。要找到一種合適、簡(jiǎn)便高效的人ES細(xì)胞培養(yǎng)方法，首先必須了解人ES細(xì)胞維持自我更新和多潛能性的分子機(jī)制。最近，有多個(gè)研究小組報(bào)道通過在成體細(xì)胞中過表達(dá)多個(gè)與ES細(xì)胞自我更新相關(guān)的基因可逆轉(zhuǎn)成體細(xì)胞的分化狀態(tài)，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變成多潛能的干細(xì)胞。這些研究不僅為干細(xì)胞臨床移植治療開辟了新的道路，同時(shí)也凸顯了ES細(xì)胞自我更新機(jī)制研究的重大意義。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：多種因素參與

4、調(diào)控人ES細(xì)胞自我更新，其中包括轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4、Nanog、Sox2等)、信號(hào)通路(TGFβ信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、FGF和P13K信號(hào)通路等)、細(xì)胞周期調(diào)控因子、microRNA、染色體穩(wěn)定性及DNA甲基化等。Oct-3/4、Nanog、Sox2是目前研究較多的參與調(diào)控人ES細(xì)胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，它們之間可相互作用形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路，共同維持人ES細(xì)胞的多潛能性。除了上述幾個(gè)關(guān)鍵基因之外，近來研究表明人ES細(xì)胞中還存

5、在其它已知或未知基因參與其自我更新的調(diào)控過程，然而它們?cè)谌薊S細(xì)胞中的功能及調(diào)控機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。 本實(shí)驗(yàn)室通過比較未分化的人ES細(xì)胞(H9細(xì)胞)和7天擬胚體(7-day EBs)的基因表達(dá)譜，通過EST拼接、5’-RACE等方法克隆得到的一個(gè)人胚胎干細(xì)胞特異性表達(dá)新基因并命名為人胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因(HESRG)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HESRG有兩個(gè)候選開放閱讀框(ORFs)，分別命名為HESRG1、HESRG2。HESRG1的起始密碼子

6、CTG位于2-4bp處，終止密碼子位于668-670bp處；編碼由222個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量為24kD。HESRG2的起始密碼子ATG位于2245-2247bp處，終止密碼子位于2485-2487bp處，編碼由80個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量為8.7kD。然而生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因此本課題的主要研究目的有兩個(gè)： 一、確定HESRG基因的ORF及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位； 二、

7、利用轉(zhuǎn)基因策略研究過表達(dá)HESRG對(duì)人ES細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 【檢測(cè)HESRG1的蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位及過表達(dá)HESRG1對(duì)人ES細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響】 HESRG1為HESRG基因的候選ORF之一，通過RT-PCR方法克隆HESRG1序列，將該序列克隆至pEF/His(C)載體與pCMV-Tag4A載體中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒(pEF/HESRG1，pcflag-HESRG1)。利用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑將pEF/H

8、ESRG1導(dǎo)入H9細(xì)胞，通過G418篩選獲得抗性克隆，進(jìn)一步采用RT-PCR，Real-time PCR檢測(cè)HESRG1的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)Xpress與HESRG1融合蛋白的表達(dá)。將pcflag-HESRG1導(dǎo)入H9細(xì)胞，72小時(shí)后通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察flag與HESRG1融合蛋白的亞細(xì)胞定位。Westernblot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEF/HESRG1的H9細(xì)胞(H9-HESRG1細(xì)胞)中可檢測(cè)到融

9、合蛋白的表達(dá)，同時(shí)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HESRG1蛋白分布于細(xì)胞核內(nèi)，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推斷HESRG1是HESRG基因的ORF。 隨后檢測(cè)過表達(dá)HESRG1對(duì)人ES細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人ES細(xì)胞過表達(dá)HESRG1后，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，不再呈克隆性生長(zhǎng)的未分化ES細(xì)胞形態(tài)，而變成多形性、分散生長(zhǎng)的、分化的人ES細(xì)胞形態(tài)，而且細(xì)胞的增殖速度明顯減慢。Real-time PCR在mRNA水平檢測(cè)人

10、ES細(xì)胞多潛能標(biāo)志基因Oct-3/4、Nanog，外胚層標(biāo)志基因Sox1、FGF5、Nestin，中胚層標(biāo)志基因BRAHYURY(T)、Hand1，內(nèi)胚層標(biāo)志基因GATA4、GATA6，滋養(yǎng)層標(biāo)志基因CGα和CGβ的表達(dá)情況，結(jié)果顯示中胚層標(biāo)志基因Hand1明顯上調(diào)，而其它胚層標(biāo)志基因改變不明顯。間接免疫熒光在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)各胚層分化標(biāo)志基因(Nestin、Hand1、GATA4)的表達(dá)，結(jié)果顯示H9-HESRG1細(xì)胞內(nèi)中胚層標(biāo)志基因H

11、and1表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而其它胚層標(biāo)志基因無明顯改變，說明過表達(dá)HESRG1將促使人ES細(xì)胞向中胚層方向分化。平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察H9-HESRG1細(xì)胞的克隆形成能力，結(jié)果顯示H9-HESRG1細(xì)胞克隆形成能力低下。同時(shí)MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明H9-HESRG1細(xì)胞的增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的H9細(xì)胞(H9-EF1細(xì)胞)。證實(shí)過表達(dá)HESRG1將會(huì)導(dǎo)致人ES細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力均下降。 【檢測(cè)HESRG2的蛋白表達(dá)

12、及其過表達(dá)對(duì)人ES細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響】 HESRG2為HESRG基因的第二個(gè)候選ORF。通過RT-PCR的方法擴(kuò)增HESRG2序列，將該序列克隆到pEF/His(B)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒(pEF/HESRG2)。將pEF/HESRG2導(dǎo)入H9細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得抗性克隆(H9-HESRG2細(xì)胞)，進(jìn)一步通過RT-PCR，Real-time PCR在mRNA水平上檢測(cè)HESRG2的表達(dá)，Western blot檢測(cè)Xpres

13、s與HESRG2融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明無法在H9-HESRG2細(xì)胞中檢測(cè)到融合蛋白的表達(dá)。 隨后檢測(cè)了過表達(dá)HESRG2對(duì)人ES細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,H9-HESRG2細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體的人ES細(xì)胞(H9-EF2細(xì)胞)在形態(tài)上無明顯差異，均表現(xiàn)為未分化人ES細(xì)胞的形態(tài)。MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察H9-HESRG2細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，過表達(dá)HESRG2對(duì)人ES細(xì)胞的增殖能力沒有明顯影響。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明過

14、表達(dá)HESRG2后，H9-HESRG2細(xì)胞的周期分布(包括G1期、S期和G2-M期)沒有明顯改變。通過擬胚體形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)H9-HESRG2細(xì)胞的體外分化能力，未發(fā)現(xiàn)H9-HESRG2細(xì)胞與H9-EF2細(xì)胞形成的擬胚體在形態(tài)上有明顯差別。同時(shí)采用RT-PCR方法檢測(cè)不同時(shí)期兩組細(xì)胞形成擬胚體中各個(gè)胚層標(biāo)志基因的表達(dá)情況，結(jié)果也顯示H9-HESRG2細(xì)胞與H9-EF2細(xì)胞形成的擬胚體各個(gè)胚層標(biāo)志基因在相同時(shí)期沒有顯著差異。 綜上所

15、述，認(rèn)為HESRG2可能位于HESRG基因的非翻譯區(qū)，并不編碼蛋白質(zhì)，過表達(dá)HESRG2對(duì)人ES細(xì)胞的生物學(xué)特性沒有顯著影響。 總之，通過本課題研究，認(rèn)為HESRG1是HESRG基因的ORF，編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核內(nèi)；HESRG的表達(dá)水平須保持在一定的范圍內(nèi)才能維持人ES細(xì)胞的未分化狀態(tài)，過表達(dá)HESRG1能促使人ES細(xì)胞向中胚層方向分化，并導(dǎo)致人ES細(xì)胞的增殖能力及克隆形成能力明顯下降；HESRG2可能位于HESRG基因的非