褪黑素對丙烯酰胺所致神經(jīng)細胞氧化損傷保護作用的研究.pdf

1、本試驗在ACR 導致PC12細胞氧化損傷的基礎(chǔ)上，研究MT對ACR所致氧化損傷的保護作用，以及對MT的可能的作用機制進行探討，為防治丙烯酰胺中毒提供科學依據(jù)。
　　 第一部分、MT對ACR所致PC12細胞毒性的保護作用
　　 目的：探討MT對ACR 引起的PC12細胞毒性的保護作用。
　　 方法：設(shè)7個組，分別為空白對照組，溶劑對照組（0.1% 無水乙醇），MT組，Luzindole組，ACR組，ACR+MT組，

2、ACR+MT+Luzindole組，后三組中ACR 劑量分別為1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，MT 終濃度為50 μmol/L，Luzindole 終濃度為0.2 μmol/L（MT和Luzindole 用無水乙醇助溶，無水乙醇含量為總體積的0.1％），處理24 h后以MTT法測定細胞存活率。
　　 結(jié)果：ACR組2.5、5、10、20、40 mmol/L的細胞生長率分別為89.04%、70.02%、55.

3、05%、44.34%、22.46% 顯著低于對照組，1.25 mmol/L細胞生長率為93.31%，與對照組差異無統(tǒng)計學意義。ACR組的細胞24 h IC50 為15.35 mmol/L。經(jīng)過濃度為50μmol/L的MT 預處理，1.25、2.5、5、10、20 mmol/L ACR 染毒計量的細胞存活率均比相應ACR單獨處理的細胞存活率高，分別為157.84%、123.83%、109.36%、85.69%、57.98%，加入MT后24

4、 h IC50 升高為22.39 mmol/L。以濃度為0.2 μmol/L的ML1 受體阻斷劑Luzindole 阻斷后，1.25、2.5、5、10 mmol/L ACR 染毒的細胞存活率仍高于單純ACR 染毒組，但較MT 保護組低，具體數(shù)據(jù)分別為125.80%、116.16%、94.53%、62.37%，20、40mmol/L ACR 染毒的細胞存活率較MT 保護組低，與單純ACR 染毒組相近，為40.17%、17.76%，其24

5、h IC50 為14.37mmol/L。
　　 結(jié)論：一定濃度的ACR 能抑制PC12細胞的生長，MT對ACR 導致的細胞毒性作用具有較好的保護作用，阻斷MT 受體ML1后，其保護作用基本消失。
　　 第二部分、MT對ACR所致PC12細胞氧化物質(zhì)生成的清除作用
　　 一、MT對ACR誘導的PPPPC12 C12細胞ROS 生成的清除作用
　　 目的：觀察MT對ACR誘導的PC12細胞ROS 生成的清除作

6、用。
　　 方法：
　　 (1)觀察ACR對ROS 影響的時間-劑量-效應關(guān)系。根據(jù)處理時間分為5個時間點（1 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每時間點三個濃度組（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5mmol/L），并設(shè)置一個空白對照組。
　　 (2)使用1.25 mmol/L和2.5 mmol/L的ACR 劑量染毒6 h，試驗分為空白對照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L M

7、T 提前24 h，同時，推后3 h 干預），ACR+MT+Luzindole組（50 μmol/L MT和0.2 μmol/L Luzindole 提前24 h，同時，推后3 h 共同處理）。
　　 結(jié)果：
　　 (1)ACR組5 mmol/L ACR染毒1 h，3 h 較對照組ROS 水平有所升高，但24 h的ROS 水平下降，結(jié)合細胞存活率結(jié)果，認為因染毒劑量高，細胞有死亡現(xiàn)象或細胞功能被抑制，出現(xiàn)活性氧水平下降。2

8、.5 mmol/L ACR染毒1 h，6 h ROS 水平高于對照組；1.25 mmol/L ACR 染毒在6 h和12 h時間點ROS 較對照組水平高。
　　 (2)提前24 h MT 干預1.25 mmol/L ACR 染毒6 h的細胞ROS 水平明顯低于ACR 染毒組，以Luzinddole 阻斷ML1 受體后與MT 干預組無顯著差別；MT 同時干預ACR，ROS 水平下降明顯，以Luzinddole 阻斷后，ROS 水平

9、上升顯著高于MT 干預組；MT 推后3 h 干預，發(fā)現(xiàn)并未能使ACR 染毒后ROS 水平降低。
　　 結(jié)論：
　　 (1)ACR對PC12細胞內(nèi)ROS 水平的影響與其染毒劑量和染毒時間均有關(guān)，劑量高ROS 水平在短時間內(nèi)就有所升高，劑量低ROS 水平上升則需要作用一定的時間。
　　 (2)提前24 h和同時MT 干預，可使ACR所致的細胞內(nèi)ROS 水平升高有所改善，起到保護作用。受體阻斷劑對同時干預的MT 有顯著

10、的阻斷作用，對提前24 hMT 干預2.5 mmol/L ACR 染毒組也有阻斷作用，但對提前24 h 干預1.25 mmol/LACR 染毒組無明顯的阻斷作用。
　　 二、MT對ACR誘導PPPPC12 C12細胞MDA 生成的清除作用
　　 目的：觀察MT對ACR 引起的PC12細胞MDA 生成的清除作用。
　　 方法：
　　 (1)觀察ACR對MDA 影響的時間-劑量-效應關(guān)系.根據(jù)處理時間分為5個

11、時間點（1 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每時間點三個濃度組（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5mmol/L），并設(shè)置一個空白對照組。
　　 (2)使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，試驗分為空白對照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L MT 提前24 h，同時，推后3 h 干預），ACR+MT+Luzindole組（50 μmol/LMT和0.2 μmol/L Luzindole 提

12、前24 h，同時，推后3 h 共同處理）。
　　 結(jié)果：
　　 (1)ACR單獨處理細胞，只有高濃度5 mmol/L ACR 染毒3 h，6 h，12 h，24 h組和對照組有顯著差異，其他組與對照組相比均無顯著性差異。
　　 (2)提前24 h MT 干預后MDA含量降低，明顯低于對照組和ACR單獨處理組，當加入Luzindole后，MDA含量升高，與單純ACR 染毒無差異。MT 同時和推后3 h 干預，細胞內(nèi)

13、MDA含量無明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 (1)較高劑量的ACR（5 mmol/L）可使細胞中的MDA含量增加。
　　 (2)提前以MT 干預，對ACR 引起的細胞內(nèi)MDA含量的增加有所清除作用，Luzindole可阻斷MT的作用。
　　 第三部分：MT對ACR降低PC12細胞SOD含量的保護作用機制初探
　　 一、MT對ACR降低PC12細胞SOD含量的保護作用
　　 目的：觀察MT對

14、ACR降低PC12細胞SOD含量的保護作用。
　　 方法：
　　 (1)試驗分為4組，一個對照組，和三個ACR 處理組，ACR 處理組濃度分別為1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L，染毒6 h。
　　 (2)使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，試驗分為空白對照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L MT 提前24 h，同時，推后3 h 干預），。
　　 結(jié)果：

15、r>　　 (1)以1.25，2.5，5 mmol/L ACR 分別處理6 h后，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L ACR組的細胞SOD 相對含量明顯低于對照組。
　　 (2)MT 提前干預24 h后，細胞內(nèi)SOD 水平上升，明顯比ACR單獨處理組高。
　　 結(jié)論：
　　 (1)較高劑量的ACR（5 mmol/L）對細胞中的SOD含量有影響。
　　 (2)說明MT 在提前作用的情況下對ACR 導致的細胞內(nèi)SOD含量降

16、低有保護作用。
　　 二、MT對ACR降低PC12細胞SOD含量的保護作用機制研究
　　 目的：對MT 保護ACR 引起PC12細胞SOD含量降低的作用機制進行初步的研究。
　　 方法：將細胞分為6個處理組，分別為對照組，ACR組，ACR+MT組(50 μmol/L MT提前24 h 干預，ACR 染毒6 h)，ACR+MT+Luzindole 處理組（0.2 μmol/L Luzindole與50 μmol/L

17、 MT 提前作用24 h），ACR+MT+PD98059（ERK 抑制劑）組（10 μmol/LPD98059與50 μmol/L MT 提前作用24h），ACR+MT+SB203580（p38 抑制劑）組（5μmol/L SB203580與50 μmol/L MT 提前作用24h），ACR 染毒6 h。
　　 結(jié)論：表明MT的作用能被MT 受體阻斷劑阻斷，而ERK和p38/MAPK 通路抑制劑對其沒有明顯的阻斷作用。