楊梅素對(duì)丙烯酰胺致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理研究.pdf

1、丙烯酰胺(Acrylamide)是一種不飽和酰胺，研究表明淀粉類食品在高溫(＞120℃)烹調(diào)下容易產(chǎn)生丙烯酰胺，如炸薯?xiàng)l、炸土豆片等中的含量均超過飲水中允許最大限量的500多倍。丙烯酰胺具有急性毒性、神經(jīng)毒性與生殖毒性、遺傳毒性和致癌性。國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)(IARC)將丙烯酰胺認(rèn)定為2A類致癌物。丙烯酰胺在我國食品加工過程中非常容易產(chǎn)生，所以了解丙烯酰胺、探索丙烯酰胺致毒機(jī)理和利用天然物質(zhì)防治其毒性顯得尤為重要。
　　本文結(jié)合體外抗

2、氧化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞模型，研究了楊梅素的抗氧化活性（氧自由基清除能力）及對(duì)丙烯酰胺致Caco-2細(xì)胞氧化損傷的防護(hù)作用，并深入探究其防護(hù)機(jī)理。
　　食品在加工過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)丙烯酰胺對(duì)人體健康威脅巨大，而從天然植物提取出來安全有效的功能因子，探索其防護(hù)丙烯酰胺致細(xì)胞損傷作用，已成為近年來功能性食品和天然藥物研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。楊梅素(Myricetin)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖和保肝等多種功效，但是有關(guān)其對(duì)丙烯酰胺所致小腸細(xì)胞

3、損傷防護(hù)作用至今未見報(bào)道。本論文以丙烯酰胺為有害應(yīng)激物質(zhì)，結(jié)合體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和Caco-2細(xì)胞模型，擬從體外抗氧化能力、細(xì)胞活力、胞內(nèi)抗氧化能力、酶活性及基因表達(dá)等幾方面運(yùn)用分子探針、熒光標(biāo)記等技術(shù)，探究楊梅素對(duì)丙烯酰胺致Caco-2細(xì)胞的損傷防護(hù)作用及其作用機(jī)理。主要結(jié)果如下:
　　(1)楊梅素體外抗氧化活性
　　采用氧自由基清除ABTS法、DPPH法和羥自由基檢測(cè)法，測(cè)定楊梅素體外抗氧化活性。結(jié)果表明:楊梅素體外抗氧化能

4、力較強(qiáng)，且呈一定的劑量依賴，設(shè)自由基清除率為50％時(shí)楊梅素濃度為IC50，則ABTS法IC50為10.41μg/mL; DPPH法IC50為5.66μg/mL;羥自由基IC50為30.18μg/mL。
　　(2)楊梅素對(duì)丙烯酰胺致Caco-2細(xì)胞的損傷防護(hù)作用
　　采用Caco-2細(xì)胞模型，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)低濃度楊梅素組分對(duì)細(xì)胞沒有毒性，丙烯酰胺會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞Caco-2氧化損傷(細(xì)胞存活率46.91％(5mM)和4

5、0.54％(10mM))。而楊梅素預(yù)處理后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，則比單獨(dú)加入丙烯酰胺的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著提高，分別提高了33.42％和31.68％，所以楊梅素能顯著抑制丙烯酰胺引發(fā)的細(xì)胞毒性。運(yùn)用動(dòng)態(tài)熒光可視技術(shù)、分子探針等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究了細(xì)胞防護(hù)作用的機(jī)理。結(jié)果表明，楊梅素能夠有效抑制由于丙烯酰胺刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧如超氧化物陰離子水平，降低細(xì)胞線粒體膜脂質(zhì)過氧化，恢復(fù)線粒體膜電位、細(xì)胞谷胱甘肽的含量，避免細(xì)胞核損傷，從而達(dá)到防

6、護(hù)細(xì)胞氧化損傷的目的。
　　(3)楊梅素防護(hù)丙烯酰胺致細(xì)胞氧化損傷作用機(jī)理的探究
　　通過細(xì)胞酶學(xué)水平，檢測(cè)細(xì)胞抗氧化酶類SOD和CAT的活性，運(yùn)用qPCR技術(shù)，檢測(cè)抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1、GCS、GSTP、GPX、SOD和CAT在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化。結(jié)果表明:楊梅素樣品（5μg/mL和10μg/mL）可以抑制并恢復(fù)由丙烯酰胺造成的SOD、CAT酶活性的降低，可見楊梅素可提高細(xì)胞內(nèi)清除自由基的抗氧化酶的活性

7、，使機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)從而防護(hù)丙烯酰胺致細(xì)胞損傷。同時(shí)AA作用下，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)NRF2、HO-1、NQO1的mRNA表達(dá);而楊梅素樣品作用下，會(huì)增加抗氧化基因的表達(dá)量，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。本研究表明楊梅素對(duì)Caco-2細(xì)胞二相解毒酶HO-1、NQO1有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，并通過恢復(fù)抗氧化酶SOD、CAT的酶活實(shí)現(xiàn)對(duì)丙烯酰胺致細(xì)胞氧化損傷的防護(hù)作用。
　　綜上所述，本文的研究結(jié)果為研究如何預(yù)防丙烯酰胺致毒提供了一種新的思