丙烯酰胺對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞毒性作用及其與波形蛋白表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯扛骨蛔⑸?、灌胃、皮膚染毒丙烯酰胺(AA)對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞損傷的影響；建立AA染毒小鼠模型，研究AA致雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡作用及對(duì)波形蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而研究波形蛋白表達(dá)與生精細(xì)胞凋亡的關(guān)系；探討AA致雄性生殖毒性作用的靶細(xì)胞，為AA生殖毒性機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法：
　　 第一部分將48只5周齡清潔級(jí)健康雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組、腹腔染毒組、灌胃染毒組和皮膚染毒組，每

2、組12只。染毒劑量為25mg/kg，連續(xù)染毒5d，每天1次。觀察染毒前后體重變化和睪丸系數(shù)。于首次染毒后第6天行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，第19天行睪丸早期精細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分將7～8周齡40只清潔級(jí)健康雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。用不同劑量的AA(0、10、20、40mg/kg)對(duì)小鼠連續(xù)灌胃5w，每周6天，其中0mg/kg給予等體積蒸餾水，即正常對(duì)照組。于首次染毒AA后第36天處死小鼠，采用組織病理學(xué)技術(shù)(

3、HE染色)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，TUNEL法，免疫組織化學(xué)法，RT-PCR技術(shù)，分別從組織學(xué)水平，細(xì)胞水平，DNA水平，蛋白水平及mRNA水平，分析AA致睪丸細(xì)胞凋亡及其與波形蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.腹腔染毒組和灌胃染毒組小鼠體重均顯著減少(P＜0.01)。三種染毒方式小鼠的睪丸重量及睪丸系數(shù)均較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。與空白對(duì)照組比較，各染毒組小鼠單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果：睪丸細(xì)

4、胞DNA的尾長、尾部DNA％、尾矩、Olive尾矩均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.三種染毒方式小鼠體重和睪丸重量均明顯小于空白對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。而與空白對(duì)照組比較，睪丸系數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。灌胃染毒組早期精細(xì)胞微核率顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，而腹腔染毒組和皮膚染毒組早期精細(xì)胞微核率雖高于空白對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　

5、　 3.HE染色結(jié)果顯示：10mg/kg組與正常對(duì)照組比較，小鼠睪丸曲細(xì)精管排列基本規(guī)則，各級(jí)生精細(xì)胞未見明顯改變。20mg/kg和40mg/kg劑量組小鼠，曲細(xì)精管排列不規(guī)則，生精上皮層次減少，各級(jí)生精細(xì)胞減少，管腔內(nèi)成熟精子減少，且有空泡形成。
　　 4.FCM結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各劑量染毒組的1C細(xì)胞明顯減少，2C細(xì)胞的比例顯著提高(P＜0.01)，且10mg/kg和20mg/kg劑量組1C和2C細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義(P＞0.05)。10mg/kg和20mg/kg劑量組4C細(xì)胞的比例較對(duì)照組增加，40mg/kg組4C細(xì)胞的比例低于前兩組，但仍高于對(duì)照組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各染毒組1C∶4C，及1C∶2C均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，但各染毒組兩兩比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。4C∶2C僅在40mg/kg劑量組與對(duì)照組比較減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 5.TUNEL法的檢測結(jié)果表明，各劑量組的細(xì)胞

7、凋亡指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 6.免疫組化結(jié)果顯示，20mg/kg組和40mg/kg組波形蛋白表達(dá)的平均光密度值較正常對(duì)照組明顯減少(P＜0.05)，10mg/kg較正常對(duì)照組減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 7.RT-PCR結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較，各劑量組小鼠睪丸波形蛋白mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論1.在本實(shí)驗(yàn)條件下，三種方式染毒AA均可致雄性小鼠睪丸細(xì)

8、胞產(chǎn)生DNA損傷，使小鼠睪丸早期精細(xì)胞微核發(fā)生率升高，且以灌胃染毒方式產(chǎn)生的毒性作用最為敏感；2.AA誘導(dǎo)可使小鼠睪丸曲細(xì)精管各級(jí)生精細(xì)胞減少，管腔內(nèi)成熟精子減少。3.AA可以降低精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子的效能，使精子細(xì)胞和精子數(shù)量減少，使生精過程發(fā)生障礙。其致細(xì)胞凋亡作用的靶細(xì)胞可能是精原細(xì)胞。4.AA誘導(dǎo)可使生精上皮凋亡指數(shù)增加，且有劑量依賴性。5.AA使得波形蛋白及mRNA的表達(dá)顯著減少，且主要是間質(zhì)細(xì)胞中的波形蛋白表達(dá)減少。推測AA生