刺參多糖SJP對神經細胞藥理活性的研究.pdf

1、研究目的：
　　刺參是海參的一種，它對人體不僅有滋補的功能，而且還有醫(yī)學和藥理的功效，可以說，海參是一種常見的傳統(tǒng)食品和民間藥物。刺參多糖有許多獨特的生物學和藥理學活性，包括抗凝血、抗血栓形成、抗腫瘤和抗骨性關節(jié)炎等。臨床試驗已經證實刺參多糖對于患有缺血性中風和缺血性心肌炎的病人有很好的療效。由此可以得出，刺參多糖是一種可以應用于治療腦缺血再灌注損傷的潛在藥物，但是其作用機理仍然不是很清楚。
　　缺氧損傷已經涉及許多中樞神經

2、系統(tǒng)(central nervous system，CNS)病理障礙，其中包括腦中風、頭部外傷、腫瘤、血管畸形和神經退行性疾病。永久性腦血流量減少將會引發(fā)腦缺血再灌注損傷，這一損傷將會導致神經細胞的功能紊亂和不可逆性壞死，嚴重時甚至會導致機體的死亡。在通常情況下，再灌注被看作是一個不錯的治療方案，然而有時候它也會導致嚴重的腦損傷，例如:腦水腫、腦出血、神經血管損傷、神經壞死和炎癥反應失控等等。到目前為止，還沒有一個很好的方法用于治療腦缺

3、血，大量的研究表明腦缺血再灌注損傷與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系。缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷是缺血、呼吸功能紊亂和腫瘤惡化等疾病的一個重要病理因素，此外，H/R損傷也能夠誘發(fā)細胞損傷。
　　帕金森疾病(Parkinson's disease，PD)是存在于衰老個體當中第二大常見的神經退行性疾病，它極大影響著患者的生活質量。在病理狀態(tài)下，PD是由黑質多巴胺能神經元損失所導致的運動功能障礙，其中包括

4、動作遲緩，靜止震顫，肌肉僵硬，步態(tài)障礙和姿勢綜合征。然而，PD的發(fā)病原因我們并不完全理解，但是我們認為氧化應激，細胞周期和炎癥反應在PD中起著重要的作用。
　　治療PD的傳統(tǒng)方法只能緩解癥狀，不能從根本上治愈神經退行性病變的過程。研究證實硫酸軟骨素對于6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞的神經損傷有明顯的保護作用。研究也證實刺參多糖SJP具有神經保護的作用。SJP可以是一種治療PD的潛在海洋藥物，但是SJP發(fā)揮神經保護的細胞內信號通

5、路機制仍然不是很清楚。
　　盡管我們對腦中風病理發(fā)展過程的理解有了重大的進展，但是在腦血管疾病中的神經障礙發(fā)病機理仍然不是很清楚。越來越多的學者認為干細胞移植可以作為一個新的治療方法用于腦中風。神經干細胞(neural stem cell，NSC)作為一類具有多分化潛能、自我更新能力的細胞，植入體內能夠在損傷區(qū)域分化為成熟神經元和膠質細胞譜系，并與宿主神經有機整合，有效恢復亞急性期和慢性期損傷的神經功能。未分化的NSC在多種CNS

6、疾病中都能夠有效的促進腦損傷組織修復再生。細胞治療是安全可行的，但是神經功能再生的機制不是很清楚。
　　細胞治療的優(yōu)點主要依靠注入細胞的正確遷移和歸巢。遷移是干細胞招募到特定區(qū)域的關鍵過程。基質細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor1 alpha，SDF-1α)和它的受體CXC趨化受體4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)在大腦CNS發(fā)展中起著很重要的作用，它能夠在神經

7、修復過程中調控遷移。SDF-1α能夠在體內和體外促進神經前體細胞(neural precursor cell，NPC)遷移并定點到達局灶性腦缺血部位，腦外傷的損傷區(qū)域或者急性神經炎癥的病理部位。SDF-1α/CXCR4軸能夠促進NSC的遷移并使神經組織再生。
　　SJP是從刺參體壁分離純化得到的一種硫酸多糖。SJP能夠促進神經球的遷移并呈濃度梯度。然而，SJP對于NSC遷移和歸巢的細胞療法仍然不是很清楚。本課題的研究目的是研究SJ

8、P增強SDF-1α/CXCR4軸促進NSC遷移的作用機制。
　　方法：
　　1.驗證SJP是否對Na2S2O4誘導的PC12細胞H/R損傷有保護作用。
　　眾所周知，神經嗜鉻細胞瘤PC12細胞株具有交感神經元的表型和生理特性，因此，PC12通常用作建立神經元模型并進行神經系統(tǒng)疾病的研究。用Na2S2O4處理細胞會導致細胞缺氧，從而建立體外氧消耗的模型。刺參多糖SJP是刺參的主要生物活性成分之一。在我們的論文中，我們用P

9、C12細胞來評價SJP對于Na2S2O4誘導H/R損傷的保護作用。在實驗過程中，SJP對于Na2S2O4誘導PC12細胞H/R損傷的保護效果我們從以下幾個方面進行檢測。我們用MTT法檢測Na2S2O4誘導PC12細胞H/R損傷的細胞存活率。用LDH，SOD和MDA檢測法進一步分析SJP對PC12細胞H/R損傷的保護作用。為了確定SJP是否可以阻斷Na2S2O4誘導PC12細胞凋亡，我們在熒光顯微鏡下觀察Hoechst33342/PI測定

10、的細胞凋亡率。為了檢測SJP對△ψm的影響，我們使用流式細胞儀檢測JC-1的染色情況。SJP對于PC12細胞H/R損傷后的HIF-1α，cyto-c在胞漿和線粒體中的比率，Bax/Bcl-2比率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53和p53的影響是通過Westernblot方法進行分析。
　　2.驗證SJP是否對6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞的PD損傷有保護作用。
　　神經母細胞瘤SH-SY5Y是一個合適的模

11、型，它可以用于研究PD疾病細胞生物化學的各個方面。6-OHDA是最廣泛用于PD模型的神經毒害藥物。因此，我們用6-OHDA處理SH-SY5Y細胞用于模擬PD的細胞模型。我們用倒置常光顯微鏡觀察SJP保護6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞損傷的細胞形態(tài)學變化。
　　結果：
　　1.SJP保護Na2S2O4誘導的PC12細胞H/R損傷。
　　SJP能夠有效的提高PC12細胞H/R損傷后的細胞存活率并且減低其導致的細胞外LD

12、H釋放。而且，SJP明顯增加SOD活性并降低MDA水平。SJP能夠有效提高H/R損傷誘導的△ψm損失。我們的實驗結果顯示SJP能夠明顯減低H/R損傷導致的細胞凋亡。SJP壓制激活的MAPK信號通路，從而使Bax/Bcl-2比率和cl-casp-3/casp-3比率以及p-p53顯著減低，也會降低cyto-c在胞漿和線粒體的比率。這種抑制細胞凋亡的現(xiàn)象呈現(xiàn)藥物濃度的依賴性。SB203580和SP600125能進一步減低Bax/Bcl-2比

13、率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53和cyto-c在胞漿和線粒體的比率。然而，U0126對這些變化并沒有影響。 MAPK信號通路與H/R損傷緊密相連。SJP能夠抑制激活的p38和JNK MAPK，而對激活的ERK并沒有影響。實驗結果顯示p38和JNK MAPK信號通路參與SJP調解緩解的PC12細胞H/R損傷。SJP處理組與H/R處理組相比，HIF-1α表達情況并沒有區(qū)別。而且，SJP，SB203580，SP600125

14、和U0126對p53的表達并沒有影響。這說明SJP增強細胞存活和降低細胞凋亡并不是通過調節(jié)HIF-1α和p53來實現(xiàn)的。
　　2.SJP保護6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞的PD損傷。
　　實驗結果顯示SJP有效減弱6-OHDA所導致的SH-SY5Y細胞形態(tài)學破壞。而且，SJP明顯降低MDA水平。SJP對于6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用與細胞周期G1/S相關并能阻斷CycIin D3蛋白的表達。與此同時，

15、SJP可以抵消激活的NF-κB信號通路并阻斷上調的iNOS蛋白表達和NO的釋放。我們的數(shù)據(jù)第一次證實SJP保護SH-SY5Y細胞免受6-OHDA損傷盡可能是與抑制NF-κB信號通路相關。
　　結論：
　　1.我們的實驗結果顯示SJP能夠減少PC12細胞H/R損傷。這種保護效果可以修復神經元的功能，促使氧化應激趨于平衡并且顯示抗凋亡的特性。SJP保護Na2S2O4誘導的PC12細胞H/R損傷是通過抑制激活的p38和JNK MA

16、PK信號通路并減低Bax/Bcl-2比率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53激活和cyto-c在胞漿和線粒體的比率。SJP抑制PC12細胞的H/R損傷呈現(xiàn)劑量依賴性，這些說明SJP可以發(fā)展成為一種預防和治療腦缺血再灌注損傷的新型藥物。
　　2.SJP能夠保護SH-SY5Y細胞免受6-OHDA誘導的細胞形態(tài)學破壞。SJP可以抵御6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞產生的氧化應激和細胞周期，這一過程主要通過抑制激活NF-

17、κB信號通路:NF-κB激活會使iNOS上調并導致NO的釋放。因此，SJP是神經退行性疾病PD的一種備選藥物。
　　3.我們的實驗結果顯示SJP和SDF-1α處理NSC可以通過PI3K/Akt/FOXO3a，ERK/MAPK和NF-κB信號通路上調Nestin，N-cadherin，TLR4，TNF-α，Cyclin D1，EGFR，Alpha6 integrin，MMP-2，MMP-9和iNOS以及SDF-1α和CXCR4自身。