海洋來源化合物對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性的篩選及作用機制研究.pdf

1、心腦血管疾病是困擾人類健康的頭號公敵，據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年約有1750萬人死于心腦血管疾病，占所有死亡人數(shù)的1/3。艾美仕醫(yī)藥健康(IMS Health)研究機構(gòu)估計，到2020年全球?qū)⒂?500萬人死于心腦血管疾病。而受困于心腦血管疾病的人群更是難以估計。
　　神經(jīng)退行性疾病是心腦血管疾病的重要分支，其主要表現(xiàn)為大腦和脊髓神經(jīng)元隨著人體老化而逐漸死亡所產(chǎn)生的認(rèn)知以及運動功能性障礙，目前的研究尚不能清楚解釋發(fā)病的原因和機理。目前

2、發(fā)病率較高的三類神經(jīng)退行性疾病為:阿茲海默癥、帕金森癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥，其病癥的初期表現(xiàn)分別為:短期記憶衰退、運動遲緩和肌無力，發(fā)展到后期會出現(xiàn):記憶障礙、小腦萎縮和肌肉萎縮，嚴(yán)重影響了人類健康和生活質(zhì)量。當(dāng)前對于神經(jīng)退行性疾病的研究還很有限，無法做的疾病治愈。市售藥物主要集中在兩類:擬神經(jīng)遞質(zhì)類藥物和神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶抑制劑，具有作用靶點單一、毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點。因此，獲得低毒性的替代治療藥物一直是研究熱點，也是本論文的研究

3、重點之一。
　　海洋藥物資源有著廣闊的開發(fā)前景，由于海洋特殊的理化環(huán)境，涌現(xiàn)了一大批結(jié)構(gòu)新穎，功能特殊，具有成藥前景的天然產(chǎn)物。殼寡糖是經(jīng)甲殼質(zhì)脫乙?；蠼到獾玫降奶烊划a(chǎn)物，研究表明其具有良好的抗炎、抗氧化等藥理活性，具有清除體內(nèi)氧自由基，保護(hù)心腦血管，降低血脂等生物功能。目前已經(jīng)作為保健食品批準(zhǔn)上市，對于殼寡糖的諸多生理調(diào)節(jié)功能也在不斷的探索研究之中;蝦青素是一種非維他命原A的類胡蘿卜素，主要存在于蝦殼，鮭魚和一些海藻體內(nèi)。蝦青

4、素具有極強的抗氧化性，是維生素E的1，000倍，而且蝦青素是目前唯一一種可以通過血腦屏障的胡蘿卜素，這些特性使得蝦青素成為一種非常理想的心腦血管保護(hù)藥物;生物堿是泛指自然界中含氮的一類有機化合物，在海洋來源的次級代謝產(chǎn)物中占有相當(dāng)?shù)谋戎?。海洋來源的生物堿活性非常廣泛，如:抑菌，消炎，抗病毒，抗腫瘤等。此外有研究報道了海洋來源的生物堿，作為一種蛋白激酶抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)的作用?？梢灶A(yù)見，隨著研究的深入，海洋這一巨大的寶庫會為人類的健康事業(yè)

5、帶來更多的驚喜。
　　糖胺聚糖，是一種直鏈、帶有負(fù)電的多糖類大分子，主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜，是蛋白多糖的主要組成成分，糖胺聚糖按照二糖結(jié)構(gòu)又可以分為以下幾種:肝素/硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，透明質(zhì)酸和硫酸角質(zhì)素等。肝素是已在臨床上使用了近80年的抗血凝藥物，也是世界上產(chǎn)量和銷售額最大的糖類藥物，由其衍生出的肝素類藥物2009年全球銷售額已達(dá)69億美金，而近年來肝素類藥物的銷量更是以年平均20％的速度在遞增。硫酸軟

6、骨素則被用于關(guān)節(jié)炎的治療而透明質(zhì)酸因其良好的保水性和組織相容性，廣泛用于美容和眼科手術(shù)中。
　　研究表明，糖胺聚糖的作用靶點主要位于細(xì)胞外，不僅參與血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫調(diào)節(jié)，而且涉及到細(xì)胞粘附、識別以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理活動。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，糖胺聚糖同樣有著舉足輕重的作用，研究表明Ext是小鼠合成HS的關(guān)鍵酶，研究人員利用敲除技術(shù)，敲除經(jīng)由Nestin-Cre介導(dǎo)的Ext后發(fā)現(xiàn)小鼠大腦的發(fā)育從三個方面被擾亂:1、大腦的

7、區(qū)域劃分混亂，沒有硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)的情況下，小鼠的中腦和小腦的區(qū)域無法完全分離，這是因為細(xì)胞表面的HS起到形態(tài)發(fā)生素(morphogen)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并且可以保護(hù)形態(tài)發(fā)生素免于被降解;2、大腦皮層神經(jīng)元的生長受到抑制，大腦皮層神經(jīng)元的生長主要發(fā)生在胚胎階段，且受到多種生長因子的調(diào)控，這其中包括FGF家族，而已有的研究證明FGFs是受HSPG調(diào)控的;3、神經(jīng)細(xì)胞軸突的引導(dǎo)作用受阻，目前機理研究尚不十

8、分明確，有觀點認(rèn)為HS可能是起到環(huán)境因素的作用，控制引導(dǎo)分子的分布。此外，糖胺聚糖在神經(jīng)元的損傷修復(fù)中也扮演了重要的角色。Del等人報道了腦部受損后，利用硫酸軟骨素酶處理神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)促軸突的再生;Butler等人發(fā)現(xiàn)硫酸角質(zhì)素蛋白多糖對于海馬區(qū)的苔蘚纖維有引導(dǎo)作用。
　　然而，目前對于糖胺聚糖在神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域的探索主要集中在功能性研究，對于糖胺聚糖在神經(jīng)細(xì)胞分化、發(fā)育過程中的組成和含量變化卻鮮有報道。因此，對于糖胺聚糖在神經(jīng)細(xì)胞分化過程

9、中的含量和組成變化成為了本課題的研究目的之一。
　　PC12細(xì)胞是一種來自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的體外培養(yǎng)細(xì)胞系，該細(xì)胞因為具有神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)受體，對NGF具有可逆的神經(jīng)元分化作用，表現(xiàn)出交感神經(jīng)元活性。被廣泛的應(yīng)用于體外神經(jīng)系統(tǒng)分化和病理學(xué)研究。我們利用PC12細(xì)胞的這種體外分化特性，研究了細(xì)胞分化過程中細(xì)胞形態(tài)、蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞表面糖胺聚糖含量組成的變化;同時利用分化型的PC12

10、細(xì)胞構(gòu)建了神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸鹽(glutamate)損傷模型，對具有神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)功能的潛在化合物進(jìn)行了篩選。主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　一、從細(xì)胞分化率和軸突伸展長度兩方面綜合考慮NGF的作用濃度為20 ng/ml。高于此濃度(50，100 ng/ml)時，細(xì)胞的神經(jīng)突伸展明顯，但是分化后期的細(xì)胞整體分化率較低。
　　二、在加入NGF誘導(dǎo)分化的早期(0-6 h)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated p

11、rotein kinase，MAPK)家族中的ERK信號通路會被快速(＜10 min)激活，同時鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)也表現(xiàn)出相似的表達(dá)規(guī)律。
　　三、 NGF的加入會影響PC12的細(xì)胞周期，免疫蛋白印跡實驗和流式細(xì)胞實驗結(jié)果表明，細(xì)胞周期被阻滯在G1期。同時，NGF分化96 h后免疫熒光結(jié)果顯示神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific e

12、nolase，NSE)顯色呈陽性結(jié)果，表明細(xì)胞的神經(jīng)元誘導(dǎo)分化表型成功。
　　四、利用分化型PC12細(xì)胞構(gòu)建了神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，以4mM glutamate為損傷劑，進(jìn)行了一系列具有潛在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的化合物篩選，以及相關(guān)作用機理的研究工作:1）經(jīng)過乙?；揎椀募讱ぐ繁憩F(xiàn)出良好的抗細(xì)胞凋亡作用，這一現(xiàn)象只在全乙?；募讱ぐ沸揎椄脑煳锷铣霈F(xiàn)，未修飾和N-乙?；揎椀募讱ぐ肪痪哂锌股窠?jīng)細(xì)胞凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn):全乙?；募讱ぐ纺軌颍?/p>

13、i.降低細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)和活性氧族(ROS)的水平，ii.減少凋亡蛋白caspase-3和caspase-9酶的活性;降低BAX蛋白的表達(dá)量，減少BAX/Bcl-2的相對比值。2)天然產(chǎn)物蝦青素顯著提高了PC12的細(xì)胞存活率，研究表明:蝦青素可以，i.有效降低Ca2+內(nèi)流，ii.穩(wěn)定線粒體膜電位，阻止細(xì)胞凋亡，iii.減少核素NfκB的入核現(xiàn)象，降低細(xì)胞色素C的釋放。3）對68例新合成的化合物進(jìn)行了活性篩選，研究了化合物與活性

14、之間的構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果表明在合適的位置引入甲氧基(-OCH3)能夠有效的提高化合物的抗細(xì)胞凋亡活性。
　　五、提取出未分化和不同分化狀態(tài)的PC12細(xì)胞糖胺聚糖，利用HPLC和HPLC-MS進(jìn)行單糖組成和含量的研究。
　　本文利用神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)模型對活性化合物篩選并探討了相關(guān)作用機制，對化合物的合成和改造工作提供了生物學(xué)支撐，旨在為探索和開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的藥物提供有效的思路和依據(jù)。并從單糖含量和二糖組成的角度來闡述糖胺聚糖在