天然來源化合物抗HIV的活性篩選和ADS-J1抑制HIV進(jìn)入的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的,嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。據(jù)UNAIDS統(tǒng)計,2008年全球感染HIV的人數(shù)有3340多萬,而08年新增的HIV感染者數(shù)量為270萬,因艾滋病死亡的人數(shù)高達(dá)200萬。我國自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV感染者,截止2009年10月底,估計有74萬人發(fā)生了感染,且2009年新增的感染者數(shù)量為4.8萬。在非洲的有

2、些國家,HIV的感染率達(dá)總?cè)丝?0％以上。因此,預(yù)防和治療艾滋病,已不僅僅是挽救個人生命的問題,而是關(guān)系到民族存亡的大事。由于有效的艾滋病疫苗在短時期內(nèi)還難以面世,開發(fā)高效、安全和廉價的抗HW藥物依然是挽救艾滋病人生命的關(guān)鍵舉措,也是艾滋病防治的當(dāng)務(wù)之急。目前應(yīng)用于臨床的抗HIV藥物中逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑有26種、進(jìn)入抑制劑和整合酶抑制劑才3種,但前兩類藥物容易引起病毒耐藥現(xiàn)象和嚴(yán)重的毒副作用。因此,為了治療感染了耐藥病毒的艾滋

3、病患者,組成更多有效的“雞尾酒”治療方案,必須大力開發(fā)后兩類新作用機制的抗艾滋病藥物。其中HW進(jìn)入抑制劑,由于能在病毒感染的早期進(jìn)行阻斷,更為有效地預(yù)防和治療HIV感染,而倍受重視。
　　 已被批準(zhǔn)的HW進(jìn)入抑制劑有兩種,分別是靶向HIV跨膜蛋白gp41的多肽藥物T-20(也叫融合抑制劑)和靶向HIV輔助受體CCR5的受體拮抗劑Maraviroc。Maraviroc只能作用于利用CCR5作為輔助受體的R5病毒,對以CXCR4為輔

4、助受體的X4病毒無效,而T-20則對兩類病毒均具有抑制作用。然而,T-20是多肽藥物,不能口服,容易被體內(nèi)的蛋白酶降解,而且價格昂貴不是廣大的發(fā)展中國家HIV感染者所能承受的,因此開發(fā)出具有類似作用機制的非肽類HIV進(jìn)入抑制劑迫在眉睫。
　　 本課題根據(jù)實驗室在相關(guān)領(lǐng)域積累的經(jīng)驗,與相關(guān)的研究組合作對大量的有機合成小分子和天然產(chǎn)物提取成分進(jìn)行抑制HIV進(jìn)入的體外活性篩選,并進(jìn)一步的開發(fā)完善新的實驗方法,研究公認(rèn)的HIV-1抑制劑

5、ADS-J1對gp41產(chǎn)生抑制作用的具體位點。
　　 第一章 天然來源化合物抗HIV的活性篩選
　　 目的：
　　 通過對茶黃素衍生物單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,改變原樣品顏色深,水溶性差等缺點,考察改造后的化合物體外抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合活性和相關(guān)的生物學(xué)活性,確定改造后成分的可利用度及進(jìn)一步改造的方向,為該類化合物作為HIV進(jìn)入抑制劑的作用機制研究提供依據(jù)。對番石榴葉提取成分進(jìn)行體外的免疫,分生活性檢測,篩選

6、出能在HIV-1進(jìn)入階段發(fā)揮作用的成分,并初步探討其作用機理,填補該類成分在HIV-1進(jìn)入抑制研究方面的空白。
　　 方法:
　　 1.茶黃素類衍生物的結(jié)構(gòu)改造和番石榴葉成分提取。茶黃素衍生物是文獻(xiàn)中研究最多的從紅茶中提取的TF1(theaflavin),TF2A(theaflavin-3-monogallate),TF3(theaflavin-3,3'-digallate),分別對它們的苯并酚酮七元環(huán)中的1”,2”,3

7、”,7”4個雙鍵進(jìn)行還原得到對應(yīng)的化合物TF1-4H,TF2A-4H,TF3-4H。具體操作是在Pt/C的催化下,通入H2還原,然后過濾除掉催化劑,對還原產(chǎn)物用反相柱層析分離純化得到相應(yīng)的化合物。參照相關(guān)文獻(xiàn),番石榴葉經(jīng)兩次乙醇提取的浸膏用SA-1型大孔樹脂吸附,然后用80％(V/V)的乙醇溶液洗脫,得到總皂苷的粗品。番石榴葉的乙醇提取物用FL-1型大孔樹脂吸附,然后用0.2％NaOH溶液洗脫,得到總黃酮的粗品。番石榴葉水浸泡液回流提取

8、得到揮發(fā)油成分。
　　 2.以上樣品先用抗體特異性的檢測抗原的酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)進(jìn)行第一次篩選,有效的通過濃度梯度實驗考察量效關(guān)系,計算抑制率并確定半數(shù)抑制濃度(Half of the inhibitingconcentration,IC50)范圍。進(jìn)一步的用可直觀的從六螺旋束(six-helical bundle,6-HB)條帶變化中反映化合物抑制強

9、弱的天然非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native polyacrylamide gel eleetrophoresis,N-PAGE)確證活性。
　　 3.另外用HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞.細(xì)胞融合實驗考察改造后的茶黃素類化合物和番石榴葉的有效成分細(xì)胞水平的抑制活性。根據(jù)融合時的細(xì)胞狀態(tài),對樣品進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)實驗檢測相應(yīng)的細(xì)胞毒性。
　　 結(jié)論:
　　 1.茶多酚衍生物是文獻(xiàn)報道能對HI

10、V感染的多個環(huán)節(jié)都有抑制效果的化合物,茶黃素衍生物低濃度時沒有表現(xiàn)出抑制CD4,趨化因子受體與gp120的相互作用卻表現(xiàn)出抑制gp41核心結(jié)構(gòu)6-HB形成的活性,且觀察發(fā)現(xiàn)化合物中含有沒食子?；谋炔缓幕钚院?含的個數(shù)越多活性越好,推測其活性可能是通過化合物自身帶的微弱的負(fù)電荷與靶點(如N末端574位的賴氨酸)的正電荷形成離子鍵實現(xiàn)的。茶多酚自身的多酚結(jié)構(gòu)使它具有上述活性,但是正因為含有多個酚羥基使化合物整體易氧化,不穩(wěn)定,且與相并的

11、酚酮七元環(huán)一起形成一個大共軛體系使得化合物顏色較深,水溶性也不好。我們的研究通過對三個衍生物的酚酮七元環(huán)的雙鍵進(jìn)行還原,在不破壞酚羥基的前提下盡量減少生色基團(tuán),并對改造后的產(chǎn)物進(jìn)行體外活性檢測。還原后化合物的顏色變淺,水溶性也增加了。ELISA,N-PAGE實驗的結(jié)果都顯示改造后化合物表現(xiàn)出良好的抑制六螺旋束形成的活性。細(xì)胞融合實驗顯示茶黃素衍生物表現(xiàn)出與文獻(xiàn)報道值相似的活性,結(jié)構(gòu)改造后的三個化合物活性比改造前還好,推測可能是因為改造后

12、化合物水溶性提高,穩(wěn)定性增強,且空間構(gòu)象也發(fā)生了一些變化,相同條件下到達(dá)靶位的有效濃度提高,更加有利于化合物與靶點的結(jié)合。這些結(jié)果既為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造提供了方向又在化合物的作用機制研究方面提供了有力的證據(jù)。
　　 2.番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷雖然是混合成分,但主要成分黃酮和皂苷含量都在55％以上。二者都能在很大范圍內(nèi)安全有效的抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合,這說明二者可以在HIV的進(jìn)入階段起到抑制作用,且細(xì)胞毒性實驗證明在

13、有效范圍內(nèi)樣品對細(xì)胞的生長沒有抑制作用。而靶向gp41的抗體免疫實驗ELISA表明二個樣品都可以在微克每毫升的水平抑制gp41核心構(gòu)象6-HB的形成,該結(jié)果還被N-PAGE實驗證實,這說明二者在進(jìn)入過程中的抑制作用可能是通過抑制了該過程中很重要的環(huán)節(jié)六股螺旋體的結(jié)構(gòu)形成來實現(xiàn)的。
　　 第二章 ADS-J1抑制HIV進(jìn)入的作用機制研究
　　 目的：
　　 通過建立和完善酸性非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid na

14、tivepolyacrylamide gel electrophoresis AN-PAGE),研究和探討ADS-J1與gp41相互作用的機制。
　　 方法:
　　 建立并完善AN-PAGE,在已有的ELISA,N-PAGE等結(jié)果的支持下更清楚直接的反映ADS-J1(4-羥基-5-((E)-(4-(5-羥基-6-((E)-2-甲氧基-5-磺苯基)二氮烯基)-7-磺基萘-2-苯基氨基)-6-苯胺-1,3,5-三嗪-2-苯基

15、氨基)-5-甲氧基-2-甲基苯)二氮烯基)萘-2,7-二磺酸在HIV-1gp41上的作用位點,為其機制研究提供直接可靠的證據(jù)。
　　 結(jié)論:
　　 AN-PAGE的結(jié)果表明,從含有20000個化合物的化合物庫中篩選出來的偶氮化合物ADS-J1對HIVgp41的作用是通過與gp41核心結(jié)構(gòu)中的NHR同源三聚體螺旋結(jié)構(gòu)表面的疏水深穴的第574位賴氨酸相互作用來實現(xiàn)的,可能是由于ADS-J1自身的磺酸基團(tuán)與賴氨酸的正電荷之間形