以度魯特韋為基礎(chǔ)藥物的抗HIV-1體外藥效學(xué)研究及天然產(chǎn)物抗HIV-1作用機(jī)制和作用特點(diǎn)研究.pdf

1、高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART)是艾滋病的常規(guī)治療方法，該方法采用一個(gè)基礎(chǔ)藥物與兩個(gè)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。整合酶抑制劑通過抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄生成的雙鏈DNA整合至宿主染色體發(fā)揮抗HIV活性，可作為基礎(chǔ)藥物使用。度魯特韋（Dolutegraver, DTG）是一種安全高效且具有較高基因屏障和良好藥代特性的整合酶抑制劑。本論文結(jié)合我國一線抗病毒治療方案，以野

2、生HIV-1、核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥HIV-1（HIV-1 RT-D67N,K70R,T215F）及整合酶抑制劑耐藥HIV-1（HIV-1IN-G140S,Q148H）重組病毒模型為代表，比較了以整合酶抑制劑DTG與非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑依法韋倫(Efavirenz，EFV)和奈韋拉平(Nevirapine，NVP)作為基礎(chǔ)藥物聯(lián)合應(yīng)用的體外藥效學(xué);同時(shí)比較了DTG和同類藥物雷特格韋（Raltegravir, RAL）分別與兩個(gè)核苷類

3、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的體外藥效學(xué)。結(jié)果顯示，以DTG為基礎(chǔ)藥物抑制野生HIV-1的藥效優(yōu)于非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，與RAL效果相當(dāng);對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥HIV-1的藥效與非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑相近;對(duì)整合酶抑制劑耐藥HIV-1的藥效優(yōu)于RAL。研究結(jié)果為臨床選擇藥物提供了參考。
　　盡管HAART顯著延長了艾滋病患者的生存期，但患者長期服藥后仍會(huì)由于耐藥病毒的出現(xiàn)或嚴(yán)重副作用而導(dǎo)致治療失敗，最終面臨無藥可用的困境，因此研發(fā)

4、更為安全有效的抗艾滋病藥物具有重要意義。本論文應(yīng)用VSVG/HIV-1重組病毒篩選模型得到了兩類HIV-1復(fù)制抑制劑:丹參來源的化合物NPB524和NPB527，IC50分別為1.6 nmol·L-1和0.38μmol·L-1;雷公藤植物來源的化合物KET30、KET30C、KET31A和KET31C，IC50分別為5.27μmol·L-1、0.027μmol·L-1、6.04μmol·L-1和0.09μmol·L-1。
　　本論

5、文進(jìn)一步研究了化合物NPB524和NPB527的抗HIV-1作用機(jī)制。首先，通過在病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)加入化合物檢測半數(shù)失效時(shí)間實(shí)驗(yàn)(TOA)可初步判斷化合物的作用環(huán)節(jié)，結(jié)果顯示化合物NPB524和NPB527在病毒感染細(xì)胞20h整個(gè)過程中皆有抑制活性。由于該重組病毒模型僅涉及HIV-1逆轉(zhuǎn)錄、整合和轉(zhuǎn)錄翻譯三個(gè)過程，提示這兩個(gè)化合物可能作用于病毒復(fù)制的靠后環(huán)節(jié)即轉(zhuǎn)錄翻譯環(huán)節(jié)，同時(shí)也不排除多環(huán)節(jié)阻斷病毒復(fù)制或影響了宿主因素的可能性。

6、其次，應(yīng)用ELISA和熒光素法測定了化合物對(duì)逆轉(zhuǎn)酶RNA依賴的DNA聚合酶活性(RNAdependent DNA polymerase，RDDP)和RNase H活性的影響。結(jié)果顯示，NPB524和NPB527皆能劑量依賴地抑制逆轉(zhuǎn)錄酶RDDP活性(IC50:70.6μmol·L-1和63.5μmol·L-1)和RNase H活性（IC50:49μmol·L-1和26.2μmol·L-1），為逆轉(zhuǎn)錄酶雙重酶活性抑制劑。綜合分析，NPB5

7、24和NPB527除作用于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，可能還存在其他作用靶點(diǎn)。
　　本研究還應(yīng)用臨床常見非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥毒株(HIV-1RT-K103N和HIV-1RT-Y181C)在細(xì)胞和酶水平研究了活性化合物的作用特點(diǎn)。結(jié)果顯示，NPB524對(duì)這兩種耐藥毒株的抑制活性與野生型相近，優(yōu)于奈韋拉平。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NPB524對(duì)Y181C突變逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性無抑制作用，提示NPB524除作用于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，還存在其他作用靶點(diǎn)。另外，NP