HIV-1Env來源糖肽的表達(dá)、純化及其阻斷HIV-1粘附的體外實驗研究.pdf

1、目的:在黏膜感染的過程中,HIV-1可以通過包膜蛋白表面的糖鏈與樹突狀細(xì)胞表面的C型凝集素受體 DC-SIGN結(jié)合,從而促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的播散。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)一組來自 HIV-1 AE2f包膜蛋白的糖基化位點(diǎn)能夠與 DC-SIGN結(jié)合,具有潛在的阻斷 HIV-1與 DC-SIGN結(jié)合的能力。為了驗證其是否具有阻斷 HIV-1感染的活性,本研究構(gòu)建了表達(dá)包含上述糖基化位點(diǎn)的短肽,并通過體外實驗驗證其拮抗 HIV-1感染的能力。<

2、br>　　方法:(1)根據(jù)前期試驗數(shù)據(jù)選取 HIV-1(AE亞型)V4環(huán)區(qū)382/388糖基化位點(diǎn),進(jìn)行6次串聯(lián)重復(fù)設(shè)計,加上病毒自身信號肽和6×His標(biāo)簽,命名為 AE-Sexttet。序列交由上海捷銳生命科技有限公司合成。(2)將糖肽基因用BamH I/Xba I雙酶切,克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒 pSV1.0。將得到的質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá),收細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB驗證表達(dá),并通過分子量判斷糖基化程度。(3)構(gòu)建 DC-SIGN真核表達(dá)質(zhì)粒

3、并在293T細(xì)胞中表達(dá),將表達(dá) DC-SIGN的細(xì)胞裂解液作為 Lectin-Blotting結(jié)合液,與SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)印至 PVDF膜上的糖肽結(jié)合,通過檢測結(jié)合到膜上的DC-SIGN判斷糖肽的活性。(4)將糖肽基因構(gòu)建到含 Neo基因的載體 pCDNA3.1(+),構(gòu)建糖肽穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞,G418抗生素篩選整合了重組質(zhì)粒的陽性細(xì)胞克隆,建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,通過 RT-PCR和WB鑒定表達(dá)分泌型糖肽的陽性細(xì)

4、胞系。(5)擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)糖肽的單克隆細(xì)胞系,收取細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過 Lectin親和層析的方式純化糖肽,Western-Blotting驗證純化效果,Lectin-Blotting驗證結(jié)合活性。(6)用TZM-bl細(xì)胞驗證有、無糖肽的情況下,不同亞型 HIV-1病毒進(jìn)入細(xì)胞的情況,根據(jù)熒光素酶活性高低判斷糖肽拮抗 HIV-1假病毒粘附感染的生物學(xué)活性。
　　結(jié)果:(1)瞬時轉(zhuǎn)染后,Western-Blotting結(jié)果顯示,目的

5、蛋白的實際分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于預(yù)期分子量(前者為后者的約3倍);Lectin-Blotting結(jié)果顯示,瞬時表達(dá)的糖肽分子能夠與 DC-SIGN結(jié)合。(2)用重組 pCDNA3.1(+)-AE-Sexttet質(zhì)粒將糖肽基因?qū)?Hela細(xì)胞并經(jīng)過連續(xù)傳代篩選之后,RT-PCR和Western-Blotting檢測顯示,分泌型糖肽穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。(3) Western-Blotting結(jié)果顯示,Lectin親和層析純化后的糖肽分子,分子