木豆葉神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究.pdf

1、現(xiàn)代研究表明神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)是防治神經(jīng)退行性疾病，如老年性癡呆、重癥抑郁癥、帕金森癥和中風(fēng)等疾病的重要機(jī)制。豆科木豆屬植物木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]的葉子作為傳統(tǒng)藥物在民間被廣泛使用，近年來發(fā)現(xiàn)其提取物具有抗Aβ25-35誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記障礙及對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)活性。但是，其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的活性成分和作用機(jī)制并不清楚。本文將在活性指導(dǎo)下，對(duì)木豆葉神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性成分進(jìn)行分離，并對(duì)活性強(qiáng)的化合物進(jìn)行深入的機(jī)制

2、研究。
　　首先，制備了木豆葉醇提取物的不同部位，并進(jìn)行抗皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的四個(gè)部位均在不同程度上表現(xiàn)出抗皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)保護(hù)活性，但脂溶性部分在較低濃度時(shí)即表現(xiàn)較強(qiáng)的活性，提示著木豆葉醇提取在低極性部分具有較強(qiáng)的活性化合物。隨后，利用各種分離色譜技術(shù)及光譜技術(shù)從木豆葉活性部位中分離并鑒定23個(gè)化合物，其中黃酮類化合物9個(gè)、芪類化合物4個(gè)和其他化合物10個(gè)。它們結(jié)構(gòu)分別是木豆素(Cajanin

3、stilbeneacid)、木豆素A(Longistylin A)、木豆素C（Longistylin C）、木豆內(nèi)酯A(CajanolactoneA)、球松素(Pinostrobin)、葒草苷(Orientin)、異牡荊苷(Isovitexin)、牡荊苷(Vitexin)、Cajanol、Cajanin、櫻黃素(Prunetin)、紅車軸草素(Pratensein)、(2R，3R)-2，3-二氫-5-7，4'-二甲氧基黃酮(2R，3R-

4、2，3-dihydro-5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavone)、10'，16'-二羥基棕櫚酸乙酯(Ethyl10'，16'-dihydroxy hexadecanoate)、香草酸(Vanillic acid)、十七烷酸乙酯(Ethyl heptadecanoate)、2-O-甲基肌醇(2-Oquebrachitol)、2，3，4-三羥基異戊酸(2，3，4-trihydroxy-isovaleric acid)

5、、豆甾醇(Stigmasterol)、樺木酸(Betulinic acid)、十七烷酸(Heptadecanoic acid)、β-谷甾醇(β-sitosterol)和β-胡蘿卜苷(β-daucosterol)。
　　為了進(jìn)一步明確木豆葉中化學(xué)成分，運(yùn)用UPLC-QTof-MS技術(shù)對(duì)木豆葉乙醇提取物定性分析，鑒定出18個(gè)化合物，黃酮類14個(gè)，芪類4個(gè)。4個(gè)芪類化合物均分離得到，有8個(gè)黃酮類化合物是未分離得到，它們的結(jié)構(gòu)是:槲皮苷(

6、Quercitrin)、刺苞菊甙(Carlinoside)、異槲皮苷(Isoquercitrin)、蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、芹黃素(Apigenin)和Cajaflavanone。從UPLC-QTof-MS分析結(jié)果表明，芪類和黃酮類成分是木豆葉中的主要成分，芪類化合物主要苷元存在，未發(fā)現(xiàn)糖苷;黃酮類化合物苷元和苷均有發(fā)現(xiàn)。
　　在完成化合物分離的基礎(chǔ)上，建立PC12細(xì)胞的皮質(zhì)

7、酮損傷、谷氨酸損傷和過氧化氫損傷三個(gè)模型，對(duì)8個(gè)主要化合物（四個(gè)黃酮化合物:牡荊苷、葒草苷、球松素、Cajanol;四個(gè)芪類化合物:木豆素、木豆素A、木豆素C和木豆內(nèi)酯A）進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)活性篩選，結(jié)果表明8個(gè)化合物均在不同程度上具有一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性，但是芪類體現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)活性。木豆素和木豆素C分別對(duì)皮質(zhì)酮和谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)活性。
　　為了探討木豆芪的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性與其抗氧化之間的關(guān)系，本文采用體外

8、抗氧化評(píng)價(jià)法（化學(xué)評(píng)價(jià)和細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)）對(duì)芪類化合物的抗氧化活性進(jìn)行測定?；瘜W(xué)評(píng)價(jià)表明木豆素具有較強(qiáng)的自由基清除活性，而木豆素A具有較強(qiáng)的還原活性。細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)表明四個(gè)茋類化合物具有不同程度的抗氧化活性，木豆素能夠最大程度地降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的含量，增加細(xì)胞中SOD和CAT的活性，木豆素A次之。該實(shí)驗(yàn)表明木豆芪抗氧化的化學(xué)評(píng)價(jià)和生物學(xué)評(píng)價(jià)具有一定的相關(guān)性。為了闡明木豆芪神經(jīng)損傷保護(hù)的可能機(jī)制，本文選擇木豆素和木豆素C分別進(jìn)行抗皮質(zhì)酮和抗

9、谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制研究。
　　通過MTT（甲基噻唑基四唑）法、LDH釋放、Hoechst33342染色法和流式細(xì)胞凋亡檢測等藥效學(xué)方法，證明Longistylin C具有顯著的抗谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的活性。作用機(jī)理表明， Longistylin C能夠明顯下調(diào)由高濃度谷氨酸過度激活的天門冬氨酸受體（NMDAR/NR2B）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，上調(diào)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶1和2(p-ERK1/2

10、)、磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)。降低細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度和ROS濃度、下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP/GADD153)、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白抗體(XBP-1)、Caspase-12和Caspase-9，從而緩解由谷氨酸興奮性毒性誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時(shí)，通過逆轉(zhuǎn)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)的異常開放和線粒體膜電位(MMP)的去極化，下調(diào)細(xì)胞胞質(zhì)中的

11、細(xì)胞色素C、Caspase-3和ICAD，在一定程度上恢復(fù)線粒體的功能，從而抗谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。
　　通過MTT法、LDH釋放、Hoechst33342-PI雙染法和流式細(xì)胞凋亡檢測等藥效學(xué)方法，證明CSA具有顯著的抗皮質(zhì)酮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性。機(jī)制研究表明，CSA能夠作為組蛋白去乙酰化酶(HDAC-6)的抑制劑，下調(diào)細(xì)胞中過多的HDAC-6表達(dá)，從而導(dǎo)致熱休克蛋白90(HSP90)乙?；?，脫離其輔酶因子，與糖皮質(zhì)激素受

12、體(GR)的親和力降低，從而間接下調(diào)GR表達(dá)。另一方面發(fā)現(xiàn)，CSA具有雌激素樣作用，能夠與雌激素受體(ER)結(jié)合而激活MAPK通路，通過上調(diào)磷酸化分裂原活化抑制劑(p-MEK)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元和突觸的可塑性;同時(shí)上調(diào)磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化促凋亡蛋白(p-Bad)而激活線粒體抗凋亡途徑。此外，通過降低細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，而緩解凋亡通路

13、下游的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　本文通過神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性指導(dǎo)下的化學(xué)分離、活性篩選及機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)木豆葉醇提物中的神經(jīng)保護(hù)活性化合物主要是木豆芪類;其作用機(jī)制主要通過抑制下游的氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、恢復(fù)線粒體功能，以及調(diào)節(jié)上游受體靶點(diǎn)，達(dá)到抗細(xì)胞凋亡。
　　此外，本論文還對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的主要凋亡機(jī)制和損傷模型及木豆葉化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。本文研究為尋找神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的活性化合物或先導(dǎo)化合物提供了科學(xué)的依據(jù)，亦為