烏龍丹對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制的研究.pdf

1、本研究的主要內(nèi)容框架為下： 1.2傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制與治療的探討 傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦缺血后神經(jīng)元損害是中風(fēng)病理變化過(guò)程的一部分，近現(xiàn)代醫(yī)家普遍認(rèn)為中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制為肝陽(yáng)化風(fēng)、氣血并逆、直沖犯腦。導(dǎo)師臧堃堂教授認(rèn)為缺血性腦血管病的受病部位在脈管與腦髓，尤以脈管的病變?yōu)槠潢P(guān)鍵，氣血不足與血脈瘀阻是病機(jī)的主要方面，與諸臟腑經(jīng)絡(luò)的病變及中風(fēng)后的痰飲瘀毒、正氣虧虛三者之間又有因果的關(guān)系。概之，本病病機(jī)主要為各種內(nèi)外病因致諸

2、臟腑經(jīng)絡(luò)之病變，殃及腦部脈管與腦髓，產(chǎn)生痰飲瘀毒及正氣虧虛等病理變化過(guò)程，主張以益氣活血、養(yǎng)陰補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)為其治療要點(diǎn)。 1.3烏龍丹治療缺血性腦血管病的臨床與理論基礎(chǔ) 根據(jù)對(duì)缺血性腦血管病的病因病機(jī)理解，臧堃堂教授從益氣活血、養(yǎng)陰補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)法擬制出經(jīng)驗(yàn)方烏龍丹治療本病，全方由生黃芪、葛根、生曬參、白術(shù)、制首烏、川芎、當(dāng)歸、丹參、地龍、全蝎、制僵蠶、水蛭、石菖蒲、女貞子等十四味藥組成，其組方用藥主要從兩方面著手：脈

3、管病變?yōu)闅庋澨撆c血脈瘀阻，故治用大劑量的生黃芪、生曬參、白術(shù)大補(bǔ)脾胃之氣，扶后天以助化機(jī)，益氣以生血；丹參、當(dāng)歸、川芎、地龍、水蛭養(yǎng)血活血、化瘀通絡(luò)，配用葛根以鼓動(dòng)氣血上行進(jìn)入腦缺血區(qū)以祛瘀生新。腦髓病變?yōu)樗韬Ｌ澨撆c痰飲瘀毒，故治用制首烏、女貞子養(yǎng)陰補(bǔ)腎填髓，僵蠶、全蝎、石菖蒲平肝熄風(fēng)解痙、祛痰開(kāi)竅。以上諸藥合用共奏益氣活血、養(yǎng)陰補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)之功，從而達(dá)到治療缺血性腦血管病的目的。本課題組前期的臨床研究表明烏龍丹治療缺血性腦血管病臨

4、床療效顯著，實(shí)驗(yàn)研究也表明有多方面的藥理作用，能從不同途徑改善腦缺血后的病理變化，為本課題從神經(jīng)元保護(hù)角度探討烏龍丹治療缺血性腦血管病的研究提供了理論依據(jù)。 2實(shí)驗(yàn)研究 采用實(shí)驗(yàn)手段，探討烏龍丹對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。由于本課題組前期已對(duì)烏龍丹做了大量的研究，因而制定烏龍丹的制備與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。本研究在制定了烏龍丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并復(fù)制了大鼠局灶性腦缺血病理模型的基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物wist

5、ar大鼠(3-4月齡，250±20g)，分為假手術(shù)組、模型組、烏龍丹高劑量組、烏龍丹中劑量組、烏龍丹低劑量組。各組先予灌胃給藥一周，三實(shí)驗(yàn)組給予烏龍丹流浸膏，每日給藥劑量分別為1ml、2ml、4ml(1ml≈2.5g生藥含量)，假手術(shù)組與模型組給予生理鹽水2ml。于末次給藥后2h造模，術(shù)后連續(xù)給藥，大鼠造模24h后作相應(yīng)處理，提取樣本，進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 2.1探討烏龍丹的制備與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 建立薄層色譜法對(duì)烏龍丹方中首烏、

6、黃芪、當(dāng)歸、葛根、川芎等藥材進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果重復(fù)性好，用高效液相色譜法對(duì)方中葛根素、人參皂苷Rg1進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果提取率穩(wěn)定。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檢測(cè)葛根素、人參皂苷Rg1含量可作為烏龍丹質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo)，為控制本品質(zhì)量打下基礎(chǔ)。 2.2建立大鼠局灶性腦缺血病理模型 采用開(kāi)顱法制作大鼠局灶性腦缺血模型，結(jié)果表明成功率較高，可達(dá)90％以上，缺血效果可靠，梗塞區(qū)域恒定，其病理改變與人類缺血性中風(fēng)較為接近，且手術(shù)方法簡(jiǎn)便易行

7、，對(duì)動(dòng)物損傷小，死亡率低，表明采用這一模型符合本課題進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。 2.3探討烏龍丹對(duì)局灶性腦缺血神經(jīng)元損傷的保護(hù)效應(yīng) 運(yùn)用光鏡與電鏡觀察了各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞損害情況，光鏡下可見(jiàn)，模型組空泡形成明顯，部分神經(jīng)元周圍間隙擴(kuò)大，神經(jīng)細(xì)胞死亡多，殘存細(xì)胞少，烏龍丹三劑量組神經(jīng)細(xì)胞較為致密，胞漿濃縮較輕，神經(jīng)細(xì)胞死亡減少。對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，壞死與凋亡兩種細(xì)胞死亡形態(tài)均出現(xiàn)，烏龍丹各劑量組

8、細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明烏龍丹能減輕大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞的損害，對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)。 2.4探討烏龍丹對(duì)大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)元凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)的影響 通過(guò)免疫組化試驗(yàn)，計(jì)算各組神經(jīng)元TUNEL染色及bcl-2、caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果：與假手術(shù)組對(duì)比，模型組腦組織TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(P＜0.001)，Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

9、下降(P＜0.001)；與模型組對(duì)比，烏龍丹三劑量組均可降低腦組織TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，增加Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P＜0.001)。以上結(jié)果表明烏龍丹能通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)抗大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化，從而產(chǎn)生對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。 2.5探討烏龍丹對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織中氧自由基的影響 對(duì)各組氧自由基相關(guān)物進(jìn)行檢測(cè)，其中SOD檢測(cè)用黃嘌呤氧

10、化酶法，MDA檢測(cè)用TBA顯色法，結(jié)果：烏龍丹能提高缺血后腦組織中SOD活性并降低MDA含量，提示烏龍丹能調(diào)控缺血后腦組織中SOD活性與MDA含量，從而減弱自由基的毒性反應(yīng)。 2.6探討烏龍丹對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織中興奮性氨基酸的影響 用氨基酸分析儀測(cè)定各組興奮性氨基酸的含量，結(jié)果：與假手術(shù)組對(duì)比，模型組腦組織Glu、Asp、Gly、GABA含量升高(Pglu=0.012，Pasp＜0.001，Pgly＜0.001，P

11、GABA=0.003)；與模型組對(duì)比，烏龍丹三個(gè)劑量組均可降低腦組織Glu、Asp、Gly含量(P＜0.05)；烏龍丹三劑量組能降低腦組織GABA含量，但差異無(wú)顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏龍丹可調(diào)控缺血后腦組織中興奮性氨基酸含量，拮抗興奮性氨基酸的毒性反應(yīng)，從而起到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。 3臨床研究 臧堃堂教授是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)，博士生導(dǎo)師，師承制導(dǎo)師，數(shù)十年的臨床與教學(xué)工作，積累了寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)，凝集成獨(dú)特的學(xué)術(shù)思想，本文揖其

12、要從六個(gè)部分作簡(jiǎn)要介紹。 3.1“《大醫(yī)精誠(chéng)》，醫(yī)家必讀”：臧老認(rèn)為入門中醫(yī)學(xué)必先精讀唐代大醫(yī)家孫思邈之《大醫(yī)精誠(chéng)》論，并反復(fù)教導(dǎo)學(xué)生：“欲做大醫(yī)者，須在精誠(chéng)二字上下功夫”，須按大醫(yī)精誠(chéng)之內(nèi)容，精研醫(yī)藥，全心全意為人民服務(wù)，并身體力行，以身作則，不辭艱辛，體現(xiàn)了名老中醫(yī)首重醫(yī)德醫(yī)風(fēng)思想。 3.2“論藥處方，參酌古今”：臧老從事中藥方劑教學(xué)數(shù)十載，對(duì)中藥學(xué)、方劑學(xué)造詣?lì)H深，從中藥材品質(zhì)的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別，飲片的如法炮制、保管調(diào)

13、配，西藥的中醫(yī)認(rèn)識(shí)，藥對(duì)組成與應(yīng)用，經(jīng)方時(shí)方驗(yàn)方的應(yīng)用，都有精辟見(jiàn)解與創(chuàng)新，其論藥處方，善于參酌古今，力求全面理解掌握，體現(xiàn)了名老藥師的治藥思想與用藥經(jīng)驗(yàn)。 3.3“審因論治，衷中參西”：臧老認(rèn)為不管中醫(yī)西醫(yī)，中藥西藥，能看好病的醫(yī)藥，就是老百姓需要的東西，就是科學(xué)。兩大醫(yī)學(xué)體系為人類的健康都做出了巨大貢獻(xiàn)，臨床診治時(shí)切不可厚此薄彼、顧此失彼，力求做到衷中參西，使中西醫(yī)各展已長(zhǎng)，體現(xiàn)了臧老中西醫(yī)結(jié)合的臨床診療思想。 3.

14、4“雜病治則，師宗仲景”：雜病有病機(jī)復(fù)雜、變化多的特點(diǎn)。臧老臨床工作中推宗仲景對(duì)雜病的治療法則，始終貫徹了治未病思想、調(diào)養(yǎng)脾腎思想、扶正祛邪思想，展現(xiàn)了臧老臨證治療特點(diǎn)。 3.5“臨證精華，與人規(guī)矩”：癌癥、中風(fēng)病、濕熱病是臨床常見(jiàn)的難治病癥，臧老通過(guò)數(shù)十年的臨床實(shí)踐，體會(huì)到扶正抗癌是治療癌癥總的綱領(lǐng)，主張益氣活血為主治療缺血性腦血管病，善用益氣養(yǎng)陰法治療陰虛濕熱型病證，均能取得滿意療效，展現(xiàn)了臧老臨證精華。 3.6“習(xí)