褪黑素對(duì)大鼠局灶性腦缺血保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是常見(jiàn)的一種導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的疾病，缺血過(guò)程中神經(jīng)元損傷的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，可能包括自由基損傷、興奮性氨基酸的毒性作用、炎癥白細(xì)胞的損害、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等多種因素。近幾年的研究熱點(diǎn)多集中在自由基氧化反應(yīng)與炎癥白細(xì)胞引起的繼發(fā)性腦損傷兩方面。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體合成分泌的重要神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，是一種很重要的自由基清除劑，從而起到抗氧化的作用。另外有研究，MT能抑制缺血心肌中白細(xì)胞的浸潤(rùn)，能抑制

2、二硝基苯磺酸引起的炎性結(jié)腸組織中白細(xì)胞的浸潤(rùn)，能否抑制缺血時(shí)腦組織中白細(xì)胞的浸潤(rùn)未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性永久性腦缺血模型，采用HE、分光光度計(jì)、免疫組織化學(xué)、電鏡等方法觀察缺血后大腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)、核因子-κB(nuclear

3、factor-[kappa]B，NF-κB)的變化，并經(jīng)過(guò)腹腔注射MT(在術(shù)前30分鐘腹腔注射20mg/kg)，觀察MT對(duì)腦缺血性損傷時(shí)大腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及MDA、MPO、ICAM-1、NF-κB表達(dá)的影響。 方法：采用SD大鼠72只，雌雄不拘，體重230到250克。用線栓法造成大腦中動(dòng)脈栓塞制成腦缺血模型。實(shí)驗(yàn)分三組：正常對(duì)照組(Sham組)、缺血組(Ⅰ組)、MT治療組(MT組)，分別于術(shù)后6h、12h、24h、48h取材，每

4、個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。將鼠腦從前向后分為5等份，預(yù)先用TTC染色確定梗死的部位，后在取材時(shí)第二份迅速投入-70℃的冰箱，用于MDA、MPO的測(cè)定，第三份用4％多聚甲醛固定，用于HE和免疫組織化學(xué)，第四份取缺血側(cè)皮質(zhì)切成1mm3大小用2.5％戊二醛固定，用于電鏡觀察。 結(jié)果：1TTC染色顯示腦缺血后梗死部位位于大腦額葉、頂葉、顳葉的皮層及尾狀核、海馬等部位。 2HE染色：正常對(duì)照組大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元分布呈層狀，由淺到深依次分為分子層

5、、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層和多形細(xì)胞層。各層神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)完整，胞核大，明顯并可見(jiàn)核仁。缺血組表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂，體積縮小，與周?chē)M織間出現(xiàn)空殼區(qū)，胞核固縮深染，且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞逐漸加重，損傷嚴(yán)重的細(xì)胞呈空泡狀，有的神經(jīng)元發(fā)生液化，丟失明顯。而MT治療組與相應(yīng)的缺血組比較缺血性的腦損傷明顯減輕。 3分光光度計(jì)3.1MDA含量的變化：用分光光度計(jì)檢測(cè)所取腦組織中的MDA含

6、量，結(jié)果顯示正常對(duì)照組為16.39±3.50、14.06±3.34、14.14±2.91、15.19±4.52；缺血6h、12h、24h、48h分別為22.8±3.36、26.88±4.32、35.27±4.60、51.80±6.27，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量逐漸升高；相應(yīng)的MT治療組為16.78±1.40、17.27±3.46、23.26±5.07、34.80±5.65，與缺血組同時(shí)間點(diǎn)比較MDA含量降低。 3.2MPO活

7、性的變化：用分光光度計(jì)檢測(cè)所取腦組織中的MPO活性，結(jié)果顯示正常對(duì)照組為1.25±0.13、1.16±0.08、1.13±0.16、1.2±0.14；缺血6h、12h、24h、48h分別為2.13±0.12、3.49±0.14、3.07±0.09、2.85±0.06，高峰時(shí)間出現(xiàn)在12小時(shí)；相應(yīng)的MT治療組為1.82±0.11、2.28±0.17、2.07±0.04、2.00±0.02，與缺血組同時(shí)間點(diǎn)比較MPO活性降低。 4免

8、疫組織化學(xué)結(jié)果4.1ICAM-1：正常對(duì)照組大腦未檢測(cè)到明顯的ICAM-1陽(yáng)性血管，缺血組各組隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)ICAM-1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在12h達(dá)高峰，以后逐漸下降，各時(shí)間點(diǎn)平均陽(yáng)性血管個(gè)數(shù)分別是6.67±1.52、11.34±2.08、8.67±1.53、7.67±1.49，對(duì)應(yīng)的MT治療組各時(shí)間點(diǎn)平均陽(yáng)性血管個(gè)數(shù)分別是4.67±0.57、7.34±2.51、6.01±1.02、5.33±1.15。4.2NF-κB：NF-κB陽(yáng)性反

9、應(yīng)表現(xiàn)為胞漿或胞核棕黃色的顆粒，正常對(duì)照組大腦未檢測(cè)到明顯NF-κB陽(yáng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為少數(shù)細(xì)胞胞漿棕黃色的顆粒；缺血組各組隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)NF-κB表達(dá)逐漸減少，在開(kāi)始的6h就達(dá)高峰，各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)顆粒平均光密度乘積分別為0.44±0.05、0.36±0.04、0.30±0.03、0.26±0.04；對(duì)應(yīng)的MT治療組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)顆粒平均光密度乘積分別為0.33±0.03、0.29±0.02、0.22±0.02、0.1

10、8±0.04。 5超微結(jié)構(gòu)的變化正常對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)完整，胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體，線粒體等，核膜規(guī)整；突觸前后成分完整，前后膜清晰，間隙正常，突觸小泡多，呈圓形；血腦屏障結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)，且內(nèi)皮細(xì)胞間有完整的緊密連接；神經(jīng)纖維的軸索內(nèi)線粒體圓形或橢圓形，嵴完整，微絲微管豐富，髓鞘板層排列緊密規(guī)則。缺血組隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重，胞內(nèi)染色質(zhì)減少邊集，

11、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，水腫，線粒體腫脹，溶解消失。突觸表現(xiàn)為前后膜變薄、融合間隙消失，殘留少量的突觸小泡。與缺血組比較MT治療組缺血性損傷程度明顯地減輕。 結(jié)論：1MT能通過(guò)清除自由基對(duì)缺血的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用。2腦缺血后，NF-κB被激活，調(diào)節(jié)ICAM-1的表達(dá)，使白細(xì)胞黏附穿出血管壁使缺血腦組織損害進(jìn)一步加重。3MT通過(guò)抑制NF-κB、ICAM-1的表達(dá)，阻止白細(xì)胞入侵，通過(guò)抗炎作用對(duì)缺血的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用。4MT抑制ICAM-1的