
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
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1、第一部分:目的:構(gòu)建SUMO2/3 (small ubiquitin-like modifier 2/3)基因的MicroRNA特異性干擾質(zhì)粒,為探討抑制SUMO2/3基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)B35細(xì)胞的影響的研究奠定基礎(chǔ)。
方法:根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的SUMO2和SUMO3的DNA序列,首先克隆出SUMO2和SUMO3的功能性基因片段,并將基因片段連接到pcDNA3.1載體;然后分別設(shè)計(jì)對(duì)SUMO2和SUMO3基因特
2、異的miRNA片段,分別命名為miR2和miR3,同時(shí)設(shè)計(jì)一條非特異性序列作為陰性對(duì)照,命名為negative-miR,并將這些片段克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體上。通過(guò)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,挑選陽(yáng)性克隆,提取重組質(zhì)粒,并對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切反應(yīng),DNA測(cè)序鑒定。然后將pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3通過(guò)酶切和連接反應(yīng)將miR2和miR3同時(shí)連接到同一p
3、cDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體上,稱之為pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3,同時(shí)抑制SUMO2和SUMO3的表達(dá)。分別將相應(yīng)的功能基因片段和其對(duì)應(yīng)的抑制性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HT22細(xì)胞中,并用50μM H2O2作用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞10min,激活SUMO化通路的表達(dá),用Western-Blot在蛋白水平檢測(cè)SUMO2和SUMO3化蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,經(jīng)酶切和電泳證明序列成功插
4、入到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體預(yù)計(jì)位點(diǎn),經(jīng)DNA測(cè)序進(jìn)一步證明序列完全正確。Western-Blot結(jié)果證明pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3分別成功沉默SUMO2和SUMO3基因的表達(dá),并且pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3能夠同時(shí)沉默SUMO2/3基因的表達(dá)。
結(jié)論:成功構(gòu)建針對(duì)SUMO2/3基因特異性的miRNA真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)
5、染細(xì)胞后能夠明顯抑制SUMO2/3基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究其基因功能奠定了基礎(chǔ)。
第二部分:目的:構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3及pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR質(zhì)粒的B35細(xì)胞系,觀察SUMO2/3基因沉默對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并用OGD體外缺血模型對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,然后根據(jù)不同的再灌注時(shí)間觀察SUMO家族蛋白表達(dá)的變化。
方法:用攜帶CMV的pcDNA6
6、.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR轉(zhuǎn)染B35細(xì)胞系,用blasticidin篩選出穩(wěn)定株,用Western-Blot檢測(cè)SUMO2/3基因表達(dá)的改變,然后用CellTiter-Blue reagent試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用體外缺血模型OGD干預(yù)后,用Western-Blot檢測(cè)SUMO家族蛋白表達(dá)的變化。
結(jié)果:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcD
7、NA6.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒的B35細(xì)胞在受到應(yīng)激刺激后,SUMO2/3蛋白表達(dá)和對(duì)照組相比明顯降低;并且其細(xì)胞生長(zhǎng)速度和對(duì)照組相比3天后降低為對(duì)照組的64%。細(xì)胞經(jīng)過(guò)OGD作用后,對(duì)照組SUMO1蛋白的表達(dá)在0min時(shí)降低,然后升高,30min時(shí)到達(dá)高峰,然后有所降低,但趨勢(shì)并不是很明顯;SUMO2/3沉默組和對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差別。對(duì)照組和正常細(xì)胞組SUMO2/3化蛋白表達(dá)變化為:在0min時(shí)先降低,然后逐漸升高,
8、30min達(dá)到高峰,然后逐漸降低,至3h后基本恢復(fù)正常。和對(duì)照組及正常細(xì)胞組相比,SUMO2/3沉默組的每個(gè)時(shí)間段的SUMO2/3化蛋白表達(dá)均明顯降低,各時(shí)間段表達(dá)變化不明顯。
結(jié)論:SUMO2/3基因沉默后可以明顯降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒載體的細(xì)胞經(jīng)OGD作用后SUMO1蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯區(qū)別;SUMO2/3在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/E
9、mGFP-miR2/3質(zhì)粒的B35細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)正常細(xì)胞組及對(duì)照組明顯降低,而對(duì)照組和正常細(xì)胞組相比沒(méi)有明顯區(qū)別。
第三部分:目的:建立小鼠脊髓缺血的簡(jiǎn)單易重復(fù)的動(dòng)物模型,并檢測(cè)SUMO蛋白在其中表達(dá)的變化。
方法:將成年雌性C57Bl/6J小鼠用異氟咪麻醉后,取右側(cè)臥位,保持肛溫在37.0±0.5oC,于胸8肋間切開(kāi)1cm的切口,將一個(gè)小動(dòng)脈瘤夾放置在胸主動(dòng)脈的胸8部位,根據(jù)夾閉時(shí)間的不同,將小鼠分為對(duì)照組
10、、8 min、10min和12 min夾閉組,用激光多普勒探頭檢測(cè)夾閉后小鼠腰段脊髓表面血流的變化;同時(shí)對(duì)各組小鼠在缺血后1h、1d、3d、5d、7d進(jìn)行BBB評(píng)分檢查和Rotarod 檢測(cè);在手術(shù)7天后將腰段脊髓取出包埋固定后行HE染色,對(duì)脊髓前腳的存活神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù);同時(shí)將另外一批10min夾閉組和對(duì)照組的腰段脊髓組織,用Western-Blot檢測(cè)脊髓損傷后SUMO蛋白表達(dá)的變化。為了研究本模型對(duì)小鼠長(zhǎng)期存活的影響,我們使另一10
11、min夾閉組和對(duì)照組存活至術(shù)后28天,并對(duì)其病理生理功能進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果:在8 min 缺血組,BBB 評(píng)分在1h后下降到15分,24h基本恢復(fù)正常,而10min和12 min組,BBB評(píng)分在7天時(shí)與對(duì)照組和8 min組相比均明顯降低,差距具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Rotarod 檢測(cè)結(jié)果和BBB評(píng)分相似,在7天時(shí),8 min組和對(duì)照組相比沒(méi)有明顯區(qū)別,而10min或12 min組與對(duì)照組或8 min組相比差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
12、(p<0.01, 10min or 12 minvs. 0min or 8 min);胸段脊髓夾閉后可以引起腰段脊髓表面血流降低到夾閉前的10%;神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)元細(xì)胞的死亡和缺血時(shí)間密切相關(guān)。長(zhǎng)時(shí)程10min夾閉檢測(cè)組的小鼠有80%存活到28天,BBB評(píng)分和Rotarod檢測(cè)和對(duì)照組相比差異顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
結(jié)論:成功建立了小鼠的脊髓缺血模型,脊髓缺血后SUMO2/3蛋白表達(dá)和對(duì)照組相比明顯升高,這和
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