乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　流行性乙型腦炎又稱日本腦炎(Japanese encephalitis)，是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染所引發(fā)的人畜共患的自然疫源性疾病。乙腦在世界范圍內(nèi)傳播，尤其是東亞、東南亞、大洋洲北部地區(qū)為乙腦流行的主要地區(qū)，這些地區(qū)覆蓋了全球超過30億的人口。世界衛(wèi)生組織每年報(bào)告的乙型腦炎患者約有35，000-50，000人，死亡人數(shù)高達(dá)15，000人，存活患者中約有30

2、％-50％會(huì)留下麻痹癥、智力障礙等永久性神經(jīng)損傷后遺癥。近年來隨著全球化進(jìn)程的加速、疫區(qū)旅游人數(shù)的增加以及病毒自身變異的影響，乙腦的發(fā)病率有逐步上升的趨勢(shì)，在局部地區(qū)存在乙腦疫情的暴發(fā)與流行。由此可見，乙型腦炎仍然是對(duì)世界公共衛(wèi)生安全的嚴(yán)重威脅，急需深入研究JEV致病機(jī)理，提供更加有效的預(yù)防手段并尋找新的抗病毒策略。
　　病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，為形成對(duì)靶細(xì)胞有效的感染，病毒必須先侵入至細(xì)胞內(nèi)。病毒顆粒需要跨過細(xì)胞膜屏障

3、并穿過擁擠的細(xì)胞質(zhì)到達(dá)細(xì)胞核周特定的區(qū)域釋放基因組，才能啟動(dòng)復(fù)制過程并依次完成后續(xù)的蛋白合成、組裝與釋放。病毒入侵過程也是病毒自身與宿主細(xì)胞相互作用的過程，研究表明JEV入侵靶細(xì)胞可分為三個(gè)步驟:首先JEV通過包膜蛋白E結(jié)合至靶細(xì)胞表面受體并與之相互作用形成病毒-受體復(fù)合物，然后病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以內(nèi)吞小體的形式跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并運(yùn)輸至特定的位置，最后病毒通過膜融合作用完成病毒膜與內(nèi)體膜融合從而釋放病毒核酸。目前，對(duì)黃病毒科

4、病毒的入侵機(jī)制研究主要集中在西尼羅病毒(WNV)以及登革病毒（DENV）上，而對(duì)JEV的研究相對(duì)較少。對(duì)JEV入侵的深入研究，不僅可以解析病毒的感染機(jī)制，也可為黃病毒科病毒入侵機(jī)制的研究提供借鑒，更可探尋到新的有效的抗病毒靶點(diǎn)，從而在起始階段來阻斷病毒感染。
　　JEV感染具有嗜神經(jīng)性，易造成嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病及其并發(fā)癥，這也是導(dǎo)致乙型腦炎患者發(fā)展為重癥甚至死亡的主要原因。JEV在體內(nèi)擴(kuò)增后，經(jīng)血液循環(huán)，能夠突破血腦

5、屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而致病。然而，目前針對(duì)JEV感染神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)吞途徑上不同于JEV入侵其它非神經(jīng)類宿主細(xì)胞，可能與JEV的嗜神經(jīng)性和致病性高度相關(guān)。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，利用干擾RNA文庫(kù)對(duì)140個(gè)宿主細(xì)胞跨膜運(yùn)輸相關(guān)分子在JEV入侵人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞過程中的具體功能進(jìn)行研究，并篩選出能夠抑制JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞的宿主分子。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用針對(duì)不同宿主分子和信號(hào)通路

6、的化學(xué)抑制劑以及顯性抑制突變體系統(tǒng)分析JEV感染SK-N-SH細(xì)胞所依賴的途徑及關(guān)鍵分子。旨在探尋參與JEV入侵神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵宿主分子，闡明JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞的路徑及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　一、乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵宿主分子篩選以及內(nèi)吞途徑鑒定
　　方法:
　　采用人跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子的小干擾RNA文庫(kù)篩選能夠抑制JEV感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞的宿主分子，并采用JEV假病毒系統(tǒng)鑒定參與JEV入侵的關(guān)鍵分子。聯(lián)合運(yùn)

7、用針對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用、關(guān)鍵分子顯性抑制突變體的表達(dá)、激光共聚焦技術(shù)等分析JEV入侵所依賴的內(nèi)吞途徑。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)過JEV以及JEVpv兩輪篩選得到參與病毒入侵SK-N-SH細(xì)胞的一組宿主細(xì)胞分子。這些分子涵蓋了多個(gè)不同的功能蛋白種類，包括介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞的關(guān)鍵分子小窩蛋白1(Caveolin1)與發(fā)動(dòng)蛋白2（Dynamin2）;細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排相關(guān)調(diào)節(jié)分子CFL1、PAK1、RAC1、RHOA、RO

8、CK2;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子GRB2、PIK3C2G、PIK3CG;內(nèi)體分選與運(yùn)輸調(diào)節(jié)分子RAB5A、RAB5C、VAPA;內(nèi)體酸化調(diào)節(jié)分子V-ATPase。對(duì)JEV內(nèi)吞途徑的分析表明JEV入侵依賴小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，入侵過程可促進(jìn)Caveolin1分子的磷酸化并與Caveolin1分子共定位。JEV內(nèi)吞依賴Dynamin2的作用，但JEV入侵不依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑以及細(xì)胞巨胞飲作用。病毒內(nèi)吞入細(xì)胞后依賴Rab5功能但不依賴Rab

9、7功能。
　　結(jié)論:
　　JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞途徑為小窩介導(dǎo)的發(fā)動(dòng)蛋白2依賴型的內(nèi)吞途徑。其它內(nèi)吞途徑，如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑以及巨胞飲作用不參與JEV對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的入侵。JEV在內(nèi)吞入靶細(xì)胞后依賴Rab5的功能在胞內(nèi)運(yùn)輸。
　　二、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制
　　方法:
　　采用各Rho GTPase分子的干擾RNA、顯性抑制突變體、特異性化學(xué)抑制劑，以及聯(lián)合運(yùn)用

10、免疫共沉淀、激光共聚焦等技術(shù)手段對(duì)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排在JEV入侵SK-N-SH的作用環(huán)節(jié)與各分子的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞依賴細(xì)胞骨架的功能，能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的重排。JEV入侵依賴Rho GTPases家族RhoA與Rac1分子對(duì)肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)作用而不依賴Cdc42分子。RhoA與Rac1分子均通過下游Cofilin分子調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的重排。然而，RhoA與Rac1分子在JEV入侵

11、過程中的不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)揮作用，JEV介導(dǎo)的RhoA激活早于Rac1分子。RhoA與Rac1分子在介導(dǎo)JEV入侵過程中發(fā)揮了不同的作用，RhoA激活促進(jìn)caveolin1分子的磷酸化，而磷酸化的Caveolin1分子激活了Rac1從而促進(jìn)了病毒的內(nèi)吞。對(duì)微管蛋白的作用分析發(fā)現(xiàn)微管主要在病毒內(nèi)化入細(xì)胞后發(fā)揮作用而不影響病毒內(nèi)化的過程。
　　結(jié)論:
　　Rho GTPase家族分子RhoA與Rac1通過兩步式的肌動(dòng)蛋白重排調(diào)節(jié)機(jī)制介

12、導(dǎo)JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞。
　　三、表皮生長(zhǎng)因子受體在乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞中的作用及其機(jī)制
　　方法:
　　分別采用針對(duì)EGFR及其下游信號(hào)分子PI3K的化學(xué)抑制劑作用、RNA干擾、細(xì)胞因子作用，蛋白相互作用分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段系統(tǒng)分析EGFR及PI3K/AKT信號(hào)通路在JEV參與入侵SK-N-SH細(xì)胞中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制。并采用激光共聚焦，免疫共沉淀等技術(shù)手段分析細(xì)胞膜脂筏在JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞中的作用

13、。
　　結(jié)果:
　　酪氨酸酶抑制劑Genistein作用表明JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞依賴?yán)野彼峒っ缸饔?。JEV入侵可促進(jìn)EGFR磷酸化作用，當(dāng)下調(diào)EGFR或阻斷EGFR功能可抑制病毒入侵。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明EGFR參與JEV入侵的早期階段。阻斷EGFR及其下游PI3K/AKT信號(hào)通路均抑制了病毒介導(dǎo)的RhoA與Rac1的激活以及caveolin1分子磷酸化作用。病毒入侵促進(jìn)了脂筏在細(xì)胞膜上的區(qū)域化聚集，MβCD/Filipi

14、n化學(xué)抑制劑可阻斷病毒入侵所依賴的信號(hào)通路的激活，從而阻斷病毒侵入SK-N-SH細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　EGFR-PI3K信號(hào)通路參與了JEV入侵的起始，EGFR通過其下游直接的效應(yīng)通路PI3K/AKT信號(hào)調(diào)節(jié)了病毒入侵所依賴的RhoA與Rac1分子的激活以及后續(xù)病毒內(nèi)化所依賴的信號(hào)通路的激活。
　　小結(jié):
　　盡管JEV可以感染多種生物以及多種不同組織類型的細(xì)胞，對(duì)人類而言其最主要的威脅還在于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，

15、引發(fā)腦炎。JEV侵入神經(jīng)細(xì)胞是乙腦發(fā)病的前提，JEV主要利用宿主細(xì)胞元件和內(nèi)吞機(jī)制侵入神經(jīng)細(xì)胞，這種入侵方式一方面幫助病毒跨過細(xì)胞膜以及擁擠的細(xì)胞質(zhì)等多道屏障到達(dá)病毒復(fù)制位點(diǎn)，另一方面以這種類似運(yùn)輸貨物的方式侵入有助于病毒逃避宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。本課題在干擾RNA文庫(kù)篩選的基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究了JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞的途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明:(1)JEV通過小窩(Caveolin1)介導(dǎo)的，發(fā)動(dòng)蛋白Dynamin2依賴型的內(nèi)吞途徑侵入SK-

16、N-SH細(xì)胞。(2)JEV入侵SK-N-SH細(xì)胞需要Rho GTPases家族成員RhoA以及Rac1介導(dǎo)的兩步肌動(dòng)蛋白重排，RhoA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排促進(jìn)了Caveolin-1的磷酸化作用及其在胞膜上的聚集，從而形成利于病毒入胞的結(jié)構(gòu)區(qū)域;磷酸化的Caveolin-1引發(fā)了Rac1的激活，Rac1使得病毒通過Caveolin1介導(dǎo)的囊泡內(nèi)吞途徑入侵細(xì)胞。(3)EGFR-PI3K信號(hào)通路參與了JEV入侵的起始，介導(dǎo)了RhoA的