低分子量肝素對神經(jīng)細胞的保護作用及其機理研究.pdf

1、低分子量肝素(LOW Molecular Weight Heparin，LMWH)是二十世紀八十年代在研究肝素分子構(gòu)效時發(fā)展起來的一類新型生化藥物，是由肝素以不同的工藝分級或降解而成的低分子量的組分或片段，具有肝素的基本結(jié)構(gòu)，分子量一般為4kDa～6kDa。與肝素相比，低分子量肝素具有分子小、易吸收、生物利用度高、半衰期長、量效關(guān)系明確、低抗凝、高抗栓、出血副作用少等特點，在臨床中得到較廣泛的應(yīng)用。上世紀90年代初，有人開始探討肝素類藥

2、物在阿爾茨默病(Alzlleimerts disease，AD)中的作用，并取得了一些研究成果。目前已明確肝素是IP<,3>受體拮抗劑，可以拮抗IP<,3>所介導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣庫的內(nèi)鈣釋放。三磷酸肌醇(IP<,3>)是生物體內(nèi)重要的第二信使，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上的IP<,3>受體結(jié)合而導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca<'2+>釋放，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的多種生理生化功能。新近研究證實IP<,3>/Ca<'2+>信號通路在阿爾茨默病(AD)的病理過程中起著重要作用

3、。 本課題選用山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所研制的低分子量肝素(平均分子量為5.5KDa)，通過對其拮抗谷氨酸等誘導(dǎo)的細胞毒性；抑制神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度升高；對抗神經(jīng)細胞凋亡等方面的研究，旨在驗證和闡明LMwH神經(jīng)細胞保護作用及其可能的機制。 一、LMWH對培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元的保護作用： 通過原代培養(yǎng)大鼠大腦神經(jīng)細胞，我們研究了LMWH對神經(jīng)細胞的保護作用。使用谷氨酸、高濃度氯化鉀、過氧化氫和疊氮鈉造成神經(jīng)細胞不

4、同的損傷模型，考察LMWH對這些因素引起神經(jīng)細胞損傷的保護作用。主要通過MTT法，測定神經(jīng)細胞存活率的變化，研究LMwH對谷氨酸引起的細胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)外漏的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMWH可對抗谷氨酸、氯化鉀、過氧化氫以及疊氮鈉對神經(jīng)細胞的損傷，提高細胞存活率。10μg·m<'-1>的LMWH對上述損傷因素引起的細胞存活率分別為90.1﹪，82.7﹪，81.9﹪和75.9﹪，較相應(yīng)的模型組分別增加了13.3﹪，27.9﹪，66.3﹪和2

5、4.0﹪。谷氨酸可以非常顯著地誘導(dǎo)神經(jīng)細胞內(nèi)乳酸脫氫酶外漏，LMWH對其有抑制作用。 二、LMWH對凋亡神經(jīng)細胞的影響： 谷氨酸可造成培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細胞的凋亡，通過流式細胞儀測定細胞凋亡率，蛋白印漬的方法測定神經(jīng)細胞內(nèi)Bcl-2，Bax和Caspase 3的表達，考察LMWH對神經(jīng)細胞凋亡的影響。結(jié)果表明，谷氨酸處理后，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達下降，Bax和Caspase 3的表達升高，而LMWH各劑量組均可

6、以顯著降低細胞的凋亡率，增加Bcl-2蛋白的表達，抑制．Bax和Caspase 3的表達。 三、LMWH對神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度的影響： 采用Ca<'2+>敏感熒光指示劑Fura-2/AM負載大鼠神經(jīng)細胞，測定神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果顯示谷氨酸可明顯引起細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加(P<0.01)，LMWH可顯著抑制谷氨酸所誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣濃度升高，0.1μg·ml<'-1>的LMWH其抑制率達到52.57﹪，并隨濃度的增加

7、而增強。 四、LMwH對神經(jīng)細胞線粒體膜電位的影響： 谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)細胞損傷能引起細胞線粒體膜電位的降低。由于熒光染料羅丹明123(Rh123)主要聚集在細胞線粒體內(nèi)，通過使用流式細胞儀來測定細胞內(nèi)的Rh123熒光強度可以反映細胞線粒體膜電位的變化。LMwH能夠抑制谷氨酸引起線粒體膜電位的變化。說明了LMWH可以影響細胞內(nèi)的能量代謝，這與LMwH抗神經(jīng)細胞凋亡作用所一致。這些作用可能都參與了LMWH對神經(jīng)細胞的保護作用