低分子量肝素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)理研究.pdf

1、低分子量肝素(LOW Molecular Weight Heparin，LMWH)是二十世紀(jì)八十年代在研究肝素分子構(gòu)效時(shí)發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型生化藥物，是由肝素以不同的工藝分級(jí)或降解而成的低分子量的組分或片段，具有肝素的基本結(jié)構(gòu)，分子量一般為4kDa～6kDa。與肝素相比，低分子量肝素具有分子小、易吸收、生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、量效關(guān)系明確、低抗凝、高抗栓、出血副作用少等特點(diǎn)，在臨床中得到較廣泛的應(yīng)用。上世紀(jì)90年代初，有人開(kāi)始探討肝素類(lèi)藥

2、物在阿爾茨默病(Alzlleimerts disease，AD)中的作用，并取得了一些研究成果。目前已明確肝素是IP<,3>受體拮抗劑，可以拮抗IP<,3>所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的內(nèi)鈣釋放。三磷酸肌醇(IP<,3>)是生物體內(nèi)重要的第二信使，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上的IP<,3>受體結(jié)合而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>釋放，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的多種生理生化功能。新近研究證實(shí)IP<,3>/Ca<'2+>信號(hào)通路在阿爾茨默病(AD)的病理過(guò)程中起著重要作用

3、。 本課題選用山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所研制的低分子量肝素(平均分子量為5.5KDa)，通過(guò)對(duì)其拮抗谷氨酸等誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性；抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高；對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等方面的研究，旨在驗(yàn)證和闡明LMwH神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 一、LMWH對(duì)培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用： 通過(guò)原代培養(yǎng)大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞，我們研究了LMWH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。使用谷氨酸、高濃度氯化鉀、過(guò)氧化氫和疊氮鈉造成神經(jīng)細(xì)胞不

4、同的損傷模型，考察LMWH對(duì)這些因素引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。主要通過(guò)MTT法，測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞存活率的變化，研究LMwH對(duì)谷氨酸引起的細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)外漏的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMWH可對(duì)抗谷氨酸、氯化鉀、過(guò)氧化氫以及疊氮鈉對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞存活率。10μg·m<'-1>的LMWH對(duì)上述損傷因素引起的細(xì)胞存活率分別為90.1﹪，82.7﹪，81.9﹪和75.9﹪，較相應(yīng)的模型組分別增加了13.3﹪，27.9﹪，66.3﹪和2

5、4.0﹪。谷氨酸可以非常顯著地誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶外漏，LMWH對(duì)其有抑制作用。 二、LMWH對(duì)凋亡神經(jīng)細(xì)胞的影響： 谷氨酸可造成培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，蛋白印漬的方法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2，Bax和Caspase 3的表達(dá)，考察LMWH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，谷氨酸處理后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax和Caspase 3的表達(dá)升高，而LMWH各劑量組均可

6、以顯著降低細(xì)胞的凋亡率，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制．Bax和Caspase 3的表達(dá)。 三、LMWH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響： 采用Ca<'2+>敏感熒光指示劑Fura-2/AM負(fù)載大鼠神經(jīng)細(xì)胞，測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果顯示谷氨酸可明顯引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加(P<0.01)，LMWH可顯著抑制谷氨酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，0.1μg·ml<'-1>的LMWH其抑制率達(dá)到52.57﹪，并隨濃度的增加

7、而增強(qiáng)。 四、LMwH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響： 谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷能引起細(xì)胞線粒體膜電位的降低。由于熒光染料羅丹明123(Rh123)主要聚集在細(xì)胞線粒體內(nèi)，通過(guò)使用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的Rh123熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞線粒體膜電位的變化。LMwH能夠抑制谷氨酸引起線粒體膜電位的變化。說(shuō)明了LMWH可以影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，這與LMwH抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用所一致。這些作用可能都參與了LMWH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用