高活性低分子量肝素的制備及活性研究.pdf

1、肝素是一種硫酸化的多糖，屬于糖胺聚糖家族，主要從哺乳動(dòng)物的肥大細(xì)胞中分離得到。肝素通過與其他不同蛋白結(jié)合，可以發(fā)揮重要的生物活性。它可以激活抗凝血酶，加速抗凝血酶在凝血連鎖中抑制絲氨酸蛋白酶的速率，從而被作為一種抗凝血的藥物被廣泛的應(yīng)用。
　　 由于肝素結(jié)構(gòu)的多樣性和分子量的多分散性，使其治療窗窄，生物利用度低，半衰期短。此外肝素可能造成出血和誘導(dǎo)血小板減少(HIT)、骨質(zhì)疏松等副作用。這些缺點(diǎn)限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。因此，人

2、們研制出了新型抗凝血藥物，低分子量肝素(LMWH)。這類藥物具有鏈短、結(jié)合部位少，生物利用度高，且半衰期長等優(yōu)點(diǎn)。這種藥物具有很好的醫(yī)療前景。
　　 本篇論文研究了β-消除降解法制備低分子量肝素鈉的工藝路線，通過改變酯化時(shí)間和控制降解時(shí)間，制備出了最佳分子量范圍的低分子量肝素鈉。優(yōu)化的反應(yīng)條件為，酯化時(shí)間為25小時(shí)，酯化率為13.97％，分子量2000Da到8000Da的比例為71.1％；降解時(shí)間為1.5時(shí)，分子量2000Da到

3、8000Da的比例為66.5％。
　　 低分子量肝素作為抗凝血藥物雖然具備了許多優(yōu)點(diǎn)，但是在制備過程中，降解導(dǎo)致部分戊糖活性中心被破壞。戊糖結(jié)構(gòu)中N-，6-O-及3-O位硫酸基參與結(jié)合AT-Ⅲ，與抗凝血活性有關(guān)，其中3-O-位硫酸化極為重要。因此，本篇文章重點(diǎn)研究了低分子量肝素活性的提高，通過酶修飾的反應(yīng)，增加3-O-位硫酸化程度，大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的數(shù)量。反應(yīng)過程中需用到兩種酶，硫酸基轉(zhuǎn)移酶(3-OST-Ⅰ)

4、和芳基硫酸基轉(zhuǎn)移酶(AST-Ⅳ)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)工程菌后，能穩(wěn)定表達(dá)AST-Ⅳ和3-OST-Ⅰ融合蛋白。經(jīng)過Ni-NTAAgarose Fast Flow柱的分離純化得到了純度較高的酶，并且通過酶活性的測定，確定了酶的比活度。
　　 本篇文章用發(fā)色底物法，測定了修飾后低分子量肝素的抗FXa的活性，并用未修飾的低分子量肝素進(jìn)行比較，經(jīng)過測定FXa活性百分比，可以計(jì)算出低分子量肝素的半抑制率(IC50)

5、，結(jié)果顯示，F(xiàn)ragmin、Innohep和Lovenox三種低分子量肝素經(jīng)過修飾后與未修飾之前相比，IC50值分別降低了3.3、8.7和2.4倍，說明修飾后，抗凝血活性大大增強(qiáng)了。
　　 本文最后探討了3-OST-Ⅰ修飾的肝素經(jīng)過降解酶Heparinase的作用后，降解的寡糖片段分布。在過量的Heparinase作用下，肝素可徹底被降解成雙糖單元，但是經(jīng)過3-OST-Ⅰ修飾后的肝素，在硫酸化的葡萄糖胺與3-O-位硫酸化的葡萄糖