低分子量肝素對肝癌細(xì)胞株增殖、黏附相關(guān)特性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：（1）檢測低分子量肝素對體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞增殖的影響，通過周期及周期相關(guān)基因變化分析其分子機(jī)制。（2）檢測低分子量肝素聯(lián)合抗癌藥物順鉑后對肝癌細(xì)胞增殖的影響，分析低分子量肝素是否能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。（3）檢測低分子量肝素能否影響肝癌細(xì)胞侵襲遷移過程的關(guān)鍵步驟—早期黏附，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：（1）培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，MTT比色法檢測低分子量肝素作用后細(xì)胞生長情況。將對照組

2、和低分子量肝素處理組細(xì)胞培養(yǎng)36 h，以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的變化；RT-PCR法檢測各組細(xì)胞Skp2和c-Myc mRNA的變化情況；Western Blot檢測各組Skp2和c-Myc蛋白的表達(dá)變化。（2）體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對照組、LMWH處理組、DDP處理組和LMWH聯(lián)合DDP處理組，分別給予相應(yīng)的藥物處理36h后，MTT檢測各組細(xì)胞存活率；AO/EB雙熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率；West

3、ern Blot檢測各組細(xì)胞的活化Caspase3、Fas、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況。（3） Western Blot檢測正常肝細(xì)胞株L-02，肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2三株細(xì)胞株選擇素配體SleX的表達(dá)量；RT-PCR檢測經(jīng)不同濃度肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)液刺激后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的E-選擇素表達(dá)情況；黏附試驗(yàn)檢測三株細(xì)胞與經(jīng)刺激后的HUVECs的黏附情況。（4）選擇SleX高表達(dá)細(xì)胞株HepG2作為肝癌細(xì)胞

4、株代表，分別與條件培養(yǎng)液組，條件培養(yǎng)液+LMWH低濃度組，條件培養(yǎng)液+LMWH高濃度組處理的HUVECs共培養(yǎng)，檢測發(fā)生黏附的細(xì)胞數(shù)目是否發(fā)生變化；RT-PCR檢測上述三種處理的HUVECs上E-選擇素的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：（1）與對照組相比，經(jīng)低分子量肝素作用后的細(xì)胞的生長受到抑制，并在一定范圍內(nèi)呈時間和藥物濃度依賴性；分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，隨低分子量肝素劑量的增加，處于S期細(xì)胞的比例下降（P<0.05），而處于G0/G1期細(xì)胞比

5、例顯著上升（P<0.05）；且Skp2和c-Myc的mRNA和蛋白的表達(dá)量均呈現(xiàn)劑量依賴性減低（P<0.05）。（2）與對照組相比，低分子量肝素小劑量應(yīng)用對SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制不明顯，但低分子量肝素聯(lián)合DDP應(yīng)用后對細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用DDP處理組；凋亡檢測結(jié)果顯示，小劑量LMWH單獨(dú)應(yīng)用不能明顯增加細(xì)胞的凋亡率，但LMWH聯(lián)合DDP應(yīng)用后，細(xì)胞的凋亡率明顯強(qiáng)于DDP單獨(dú)應(yīng)用組；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合

6、用藥組活化Caspase3表達(dá)明顯增強(qiáng)；Fas在DDP單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組表達(dá)增高，但兩者表達(dá)量差別不大；Bcl-2僅在聯(lián)合用藥組表達(dá)明顯降低，Bax僅在聯(lián)合用藥組表達(dá)明顯升高。（3）選擇素配體SleX在L-02細(xì)胞株中幾乎無表達(dá)，在SMMC-7721細(xì)胞株中為低表達(dá)，在HepG2細(xì)胞株中為高表達(dá)；HUVECs經(jīng)條件培養(yǎng)液刺激5h后，E-選擇素表達(dá)明顯增加，且具有劑量依賴性。（4）低分子量肝素作用于經(jīng)條件培養(yǎng)液刺激的HUVECs后，黏

7、附的HepG2細(xì)胞數(shù)目明顯降低，具有劑量依賴性；通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)低分子量肝素能夠劑量依賴性降低E-選擇素的表達(dá)。
　　結(jié)論：（1）低分子量肝素能抑制肝癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能與降低Skp2和c-Myc的基因表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，進(jìn)而降低了細(xì)胞的增殖指數(shù)有關(guān)。（2）LMWH能增強(qiáng)DDP對肝癌細(xì)胞的增殖抑制，其機(jī)制可能是聯(lián)合應(yīng)用LMWH后調(diào)節(jié)了細(xì)胞的凋亡途徑。（3） LMWH能夠通過抑制HUVECs上E-選擇素的表達(dá)降低肝