Periostin對(duì)牙周膜干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞作用的影響.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)的構(gòu)建在生理性牙周膜重建的過(guò)程中是不可或缺的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于維持牙周膜的完整性以及牙周膜功能的行使具有一定意義。因此，牙周膜內(nèi)神經(jīng)的重建對(duì)于種植體周圍生理性牙周膜的構(gòu)建有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細(xì)胞有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，為生理性牙周膜的重建提供了重要的理論依據(jù)。因此，如何有效地促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞是本課題的核心內(nèi)容。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　擬通過(guò)研究Periostin對(duì)牙周膜干細(xì)胞(

2、hPDLSCs)定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而探索重建生理性牙周膜的可能，為種植體周圍生理性牙周膜的構(gòu)建提供重要理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分:人牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
　　1.1人牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs)的誘導(dǎo)培養(yǎng)
　　對(duì)照組:將hPDLSCs接種于六孔板，加入bFGF預(yù)誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液中bFGF的濃度為10ng/mL，在誘導(dǎo)24 h后換液，用PBS輕輕洗滌三次后再加入誘導(dǎo)液，繼續(xù)

3、進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液并拍照。
　　實(shí)驗(yàn)組:加入誘導(dǎo)液同時(shí)添加100 ng/mL的Periostin外源性刺激的牙周膜干細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液并拍照。
　　1.2 Western blot、免疫熒光檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞成神經(jīng)相關(guān)蛋白(β-tubulinⅢ、GFAP、NSE)的表達(dá)。
　　第二部分:沉默牙周膜干細(xì)胞Periostin的表達(dá)對(duì)hPDLSCs定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響
　　2.1構(gòu)建Periostin基因

4、干擾慢病毒，RT-PCR法檢測(cè)慢病毒LVX-PERIOSTIN-RNAi下調(diào)PERIOSTIN基因表達(dá)效率
　　2.2 Periostin基因的干擾慢病毒感染hPDLSCs細(xì)胞，WB、免疫熒光檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞成神經(jīng)相關(guān)蛋白（β-tubulinⅢ、GFAP、NSE）的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的hPDLSCs細(xì)胞呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則或者是梭型。經(jīng)過(guò)Periostin刺激誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)

5、胞的特征性形態(tài)。
　　2.WB及免疫熒光染色顯示，在hPDLSCs細(xì)胞中，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE均呈低表達(dá)，而經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達(dá)水平顯著升高，在此基礎(chǔ)上，使用外源性Periostin刺激后，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達(dá)水平進(jìn)一步升高。WB結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第4天時(shí)，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達(dá)水平達(dá)到一個(gè)相對(duì)的高峰，在誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天時(shí)，β-tu

6、bulinⅢ、GFAP、NSE表達(dá)水平較第4天時(shí)有所下降。
　　3.我們成功構(gòu)建了LVX-PERIOSTIN-RNAi，并使用其感染hPDLSCs細(xì)胞。進(jìn)一步采用western blot、免疫熒光法檢測(cè)了LVX-PERIOSTIN-RNAi感染后神經(jīng)細(xì)胞特異性相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在感染空載體后，外源性Periostin能夠顯著上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞特異性相關(guān)蛋白β-tubulinⅢ、GFAP、NSE的表達(dá)。而在感染LVX-PERIOS