多重分子信標(biāo)探針芯片構(gòu)建與結(jié)核桿菌耐藥基因多重突變位點(diǎn)檢測(cè)研究.pdf

1、目的： 目前對(duì)結(jié)核分枝桿菌(BacillusTuberculosis，TB)的檢測(cè)，主要靠X線、涂片、培養(yǎng)加藥敏、PCR技術(shù)等多項(xiàng)傳統(tǒng)試驗(yàn)綜合分析，方法繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)，敏感度低和特異性差，易導(dǎo)致誤診和漏診，病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重。治療結(jié)核的藥物種類(lèi)多、作用原理復(fù)雜、長(zhǎng)期濫用、臨床用藥不規(guī)范等，造成結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因突變?nèi)找鎻?fù)雜，其突變位點(diǎn)范圍廣，突變形式復(fù)雜，從單堿基突變、缺失、插入、錯(cuò)位到多位點(diǎn)、長(zhǎng)片段突變等，為準(zhǔn)確、全面檢測(cè)其耐藥

2、突變基因造成極大困難，特別是對(duì)廣泛存在的單堿基突變位點(diǎn)檢測(cè)，使用傳統(tǒng)方法包括傳統(tǒng)基因芯片有較大技術(shù)難度。其多重耐藥問(wèn)題一直是影響其治療、傳播的主要原因，傳統(tǒng)檢測(cè)方法指標(biāo)單一，提供的耐藥信息量少，因此建立快速、敏感、全面、簡(jiǎn)便的結(jié)核桿菌鑒定及多重耐藥檢測(cè)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)急需解決的問(wèn)題，也是有效治療和控制該類(lèi)致病菌的有效手段。分子信標(biāo)探針是一種具有很高單堿基突變位點(diǎn)檢測(cè)能力的核酸探針，但受結(jié)構(gòu)限制，分子信標(biāo)探針在熒光芯片領(lǐng)域的實(shí)際

3、運(yùn)用目前尚處于空白狀態(tài)。 本研究擬充分利用分子信標(biāo)探針與靶分子單堿基突變位點(diǎn)檢測(cè)特異性更強(qiáng)的特性和芯片高通量特點(diǎn)結(jié)合，研制構(gòu)建一種結(jié)核桿菌耐藥基因多重突變位點(diǎn)分子信標(biāo)(MB)探針芯片檢測(cè)技術(shù)，可直接對(duì)結(jié)核桿菌核酸及耐藥基因多重靶點(diǎn)進(jìn)行特異檢測(cè)，為結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因鑒定、流行病學(xué)調(diào)查提供新的技術(shù)手段。 方法： 1.根據(jù)GenBank找到結(jié)核分枝桿菌IS986基因序列，在PrimerPremierV5.0軟件上設(shè)

4、計(jì)引物。對(duì)反應(yīng)體系中MgCl2、引物、dNTP濃度以及引物退火溫度優(yōu)化后建立結(jié)核桿菌PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系。通過(guò)測(cè)序、靈敏性試驗(yàn)以及特異性試驗(yàn)對(duì)體系進(jìn)行綜合評(píng)估。用beacondesigner2.1軟件設(shè)計(jì)結(jié)核分枝桿菌通用分子信標(biāo)探針。通過(guò)對(duì)雜交溫度、雜交時(shí)間以及雜交方式的優(yōu)化，建立PCR反應(yīng)中及反應(yīng)后加入TB分子信標(biāo)雜交試驗(yàn)。運(yùn)用凝膠成像分析儀、熒光分光光度計(jì)、熒光顯微鏡等各種途徑對(duì)MB-PCR雜交產(chǎn)物熒光信號(hào)的觀測(cè)條件進(jìn)行摸索。進(jìn)行不同

5、熒光-淬滅分子對(duì)標(biāo)記分子信標(biāo)的觀測(cè)。 2.通過(guò)帶單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)連接方式和傳統(tǒng)生物素(biotin)-親和素(avidin)連接方式的研究對(duì)TB分子信標(biāo)與芯片固定和雜交方式進(jìn)行探索。提高分子信標(biāo)芯片雜交效率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)包括：5'寡核苷酸探針濃度；分子信標(biāo)探針濃度；雜交溫度、雜交時(shí)間、雜交液配方；點(diǎn)樣大小與點(diǎn)樣濃度；陰-陽(yáng)性區(qū)分的臨界值等。通用TB-MB芯片的臨床應(yīng)用和方法學(xué)比較。 3.NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找4種結(jié)核桿菌耐藥基因

6、主要突變區(qū)域(多重位點(diǎn))。針對(duì)以上位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增體系優(yōu)化。針對(duì)以上位點(diǎn)設(shè)計(jì)TB分子信標(biāo)探針及相應(yīng)單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針。進(jìn)行TB耐藥突變位點(diǎn)單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針芯片表面雜交系列實(shí)驗(yàn)：雜交溫度梯度實(shí)驗(yàn)(選擇45℃、50℃、55℃、60℃、65℃作雜交溫度)。雜交時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)(分2、4、6、8、10、12、14、16、18h不等時(shí)間段雜交)。靶序列濃度梯度雜交實(shí)驗(yàn)(分0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0

7、.07、0.08、0.09uM等不同濃度雜交)。熒光顯微鏡的觀測(cè)。 4.針對(duì)以上位點(diǎn)進(jìn)行的相應(yīng)TB臨床耐藥分離株P(guān)CR擴(kuò)增。各位點(diǎn)TB臨床耐藥分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。在已摸索出的最佳條件下運(yùn)用多重MB探針芯片對(duì)各位點(diǎn)TB臨床耐藥分離株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)并與測(cè)序結(jié)果對(duì)照。 主要結(jié)果： 1.優(yōu)化后的通用TB-PCR反應(yīng)體系MgCl2、引物以及dNTP最佳終濃度分別為：4mmol/l、0.04μmol/l以及0.

8、2mmol/l；退火溫度為55℃。測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的序列完全一致。體系對(duì)其它細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。檢測(cè)限度為1拷貝。水浴、PCR儀、恒溫?fù)u床的最適雜交溫度和適雜時(shí)間分別為：55℃，16h；65℃，4h；50℃，7h。熒光顯微鏡觀測(cè)MB-PCR雜交陽(yáng)性產(chǎn)物、MB-PCR雜交陰性產(chǎn)物熒光強(qiáng)度差異明顯(p＜0.01)。分子信標(biāo)熒光-淬滅效率較高的有：Cy3-BDH、FAM-DABCLYE；較差的有：Cy3-DABCLYE、FAM-BD

9、H。 2.分子信標(biāo)莖臂生物素-親和素(biotin-avidin)修飾有相當(dāng)技術(shù)難度。單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)采用淬滅分子中間標(biāo)記，莖結(jié)構(gòu)單側(cè)(淬滅分子一側(cè))延長(zhǎng)臂，能很好的結(jié)合在芯片上，且修飾技術(shù)難度低、特異性好。oligo探針最適濃度為40μmol/L。三種雜交液的雜交結(jié)果比較：0.15％SDS效果好于0.2％SDS，10×SSC效果好于5×SSC。Cy3-BDH探針濃度約15μmol/L、FAM-DABCLYE探針濃度約9μmo

10、l/L時(shí)雜交反應(yīng)達(dá)到7h以上可檢測(cè)到較強(qiáng)信號(hào)。隨著點(diǎn)樣直徑的縮小，同濃度樣本熒光強(qiáng)度不變；隨著濃度的倍比減小，點(diǎn)樣熒光強(qiáng)度也減小；對(duì)較理想?yún)^(qū)分陰陽(yáng)性的信號(hào)強(qiáng)度：Cy3-BDH濃度約10μmol/L，F(xiàn)AM-DABCLYE濃度約15μmol/L。TB-MB芯片對(duì)臨床標(biāo)本總檢出率為57.5％(23/40)，高于涂片27.5％(11/40)和培養(yǎng)35％(14/40)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理TB-MB芯片與涂片、培養(yǎng)相比差異有顯著性(分別為)x2=7.3

11、66，P＜0.01；x2=32.281，P＜0.01)。 3.準(zhǔn)確定位4種結(jié)核桿菌耐藥主要突變基因區(qū)域：耐鏈霉素：rpsl(43、88)、rrs；耐異煙肼：katG(315、463)；耐乙胺丁醇：embB(285、303、306、330)；耐利福平：ropB突變核心區(qū)域、擴(kuò)充的突變區(qū)域。針對(duì)以上位點(diǎn)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增體系并成功優(yōu)化了擴(kuò)增體系，均順利擴(kuò)增出特異性目的片段。針對(duì)以上位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)出分子信標(biāo)探針及相應(yīng)單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針。完成

12、了各位點(diǎn)分子信標(biāo)探針芯片表面雜交系列實(shí)驗(yàn)。按rps143、rps188、rrs、katG315、katG463、embB285、embB303、embB306、embB330、ropB-MB1-1、ropB-MB1-2、ropB-MB1-3、ropB-MB1-4、ropB-MB2-1、ropB-MB2-2順序，各位點(diǎn)最佳雜交條件分別是：(雜交溫度梯度實(shí)驗(yàn)：50℃、50℃、50℃、55℃、65℃、55℃、55℃、45℃、60℃、60℃、5

13、0℃、65℃、60℃、55℃、55℃；雜交時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)：12、14、14、16、12、12、8、14、10、10、10、8、12、10、8h；靶序列濃度梯度雜交實(shí)驗(yàn)：0.06、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.07、0.05、0.05、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.04uM)。熒光顯微鏡的觀測(cè)各位點(diǎn)熒光信號(hào)陽(yáng)-陰性區(qū)別明顯。 4.4種TB耐藥主要突變基因區(qū)域進(jìn)行的相應(yīng)臨床耐藥分離株P(guān)C

14、R均順利擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序：耐鏈霉素rpsL基因43位密碼子突變率65％，密碼子88為60％，且75％與43codon突變株重疊。Rrs突變率為15％，耐SM突變率多位點(diǎn)重復(fù)率較高。耐異煙肼KatG315codon突變率為50％，463位點(diǎn)突變率為37％。耐乙胺丁醇子密碼子285密碼子突變率為15％；303密碼子突變率為6％；306密碼子突變率為70％；330密碼子突變率為3％；12％未找到突變點(diǎn)，306密碼子突變率最多。耐利福平rpo

15、B全部找到該區(qū)段內(nèi)的突變位點(diǎn)且較復(fù)雜，多位點(diǎn)同時(shí)突變較多。成功運(yùn)用多重MB探針芯片對(duì)各位點(diǎn)TB臨床耐藥分離株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)，與測(cè)序結(jié)果對(duì)比有較好的一致性。 結(jié)論： 1、本研究采用多重分子信標(biāo)探針成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)4種結(jié)核桿菌耐藥基因主要突變區(qū)域多重靶點(diǎn)的檢測(cè)。研究摸索了對(duì)單堿基靶點(diǎn)突變具高靈敏及特異檢測(cè)能力的分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)模型及其雜交檢測(cè)技術(shù)。 2、設(shè)計(jì)合成了結(jié)核桿菌通用高特異性MB探針，并進(jìn)行了擴(kuò)增中/擴(kuò)增

16、后加入通用MB探針系列實(shí)驗(yàn)。通過(guò)凝膠成像分析儀、熒光分光光度計(jì)、熒光顯微鏡等各種途徑對(duì)通用MB探針雜交熒光觀測(cè)條件進(jìn)行了摸索，為熒光芯片運(yùn)用作了技術(shù)儲(chǔ)備。通過(guò)與傳統(tǒng)方法臨床標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核桿菌檢測(cè)，證實(shí)了通用TB-MB探針熒光芯片具有較高的陽(yáng)性檢出率、靈敏性、特異性。 3、單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針的設(shè)計(jì)發(fā)明對(duì)解決分子信標(biāo)探針在芯片表面的固定難題提供了一種簡(jiǎn)單思路。對(duì)解決傳統(tǒng)MB探針莖臂修蝕技術(shù)難，雜交無(wú)特異性、在多分子檢測(cè)的中高密度芯

17、片領(lǐng)域難以實(shí)際應(yīng)用等難點(diǎn)具積極意義。 4、建立了針對(duì)4種結(jié)核桿菌耐藥基因各突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系，設(shè)計(jì)、合成、篩選了相應(yīng)的多重TB分子信標(biāo)探針及其單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針，并完成進(jìn)行MB探針芯片雜交優(yōu)化系列實(shí)驗(yàn)和條件優(yōu)化。 5、成功運(yùn)用多重MB探針芯片檢測(cè)各位點(diǎn)TB臨床耐藥分離株P(guān)CR產(chǎn)物的雜交反應(yīng)。并與測(cè)序?qū)φ沼休^好的一致性。說(shuō)明對(duì)分子信標(biāo)探針對(duì)單堿基突變具較高的靈敏和特異檢測(cè)能力，引入于基因芯片領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多靶點(diǎn)堿