多重分子信標探針芯片構建與結(jié)核桿菌耐藥基因多重突變位點檢測研究.pdf

1、目的： 目前對結(jié)核分枝桿菌(BacillusTuberculosis，TB)的檢測，主要靠X線、涂片、培養(yǎng)加藥敏、PCR技術等多項傳統(tǒng)試驗綜合分析，方法繁雜、耗時長，敏感度低和特異性差，易導致誤診和漏診，病人經(jīng)濟負擔重。治療結(jié)核的藥物種類多、作用原理復雜、長期濫用、臨床用藥不規(guī)范等，造成結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因突變?nèi)找鎻碗s，其突變位點范圍廣，突變形式復雜，從單堿基突變、缺失、插入、錯位到多位點、長片段突變等，為準確、全面檢測其耐藥

2、突變基因造成極大困難，特別是對廣泛存在的單堿基突變位點檢測，使用傳統(tǒng)方法包括傳統(tǒng)基因芯片有較大技術難度。其多重耐藥問題一直是影響其治療、傳播的主要原因，傳統(tǒng)檢測方法指標單一，提供的耐藥信息量少，因此建立快速、敏感、全面、簡便的結(jié)核桿菌鑒定及多重耐藥檢測系統(tǒng)是目前國內(nèi)外實驗診斷學急需解決的問題，也是有效治療和控制該類致病菌的有效手段。分子信標探針是一種具有很高單堿基突變位點檢測能力的核酸探針，但受結(jié)構限制，分子信標探針在熒光芯片領域的實際

3、運用目前尚處于空白狀態(tài)。 本研究擬充分利用分子信標探針與靶分子單堿基突變位點檢測特異性更強的特性和芯片高通量特點結(jié)合，研制構建一種結(jié)核桿菌耐藥基因多重突變位點分子信標(MB)探針芯片檢測技術，可直接對結(jié)核桿菌核酸及耐藥基因多重靶點進行特異檢測，為結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因鑒定、流行病學調(diào)查提供新的技術手段。 方法： 1.根據(jù)GenBank找到結(jié)核分枝桿菌IS986基因序列，在PrimerPremierV5.0軟件上設

4、計引物。對反應體系中MgCl2、引物、dNTP濃度以及引物退火溫度優(yōu)化后建立結(jié)核桿菌PCR反應擴增體系。通過測序、靈敏性試驗以及特異性試驗對體系進行綜合評估。用beacondesigner2.1軟件設計結(jié)核分枝桿菌通用分子信標探針。通過對雜交溫度、雜交時間以及雜交方式的優(yōu)化，建立PCR反應中及反應后加入TB分子信標雜交試驗。運用凝膠成像分析儀、熒光分光光度計、熒光顯微鏡等各種途徑對MB-PCR雜交產(chǎn)物熒光信號的觀測條件進行摸索。進行不同

5、熒光-淬滅分子對標記分子信標的觀測。 2.通過帶單側(cè)延長臂分子信標連接方式和傳統(tǒng)生物素(biotin)-親和素(avidin)連接方式的研究對TB分子信標與芯片固定和雜交方式進行探索。提高分子信標芯片雜交效率優(yōu)化實驗包括：5'寡核苷酸探針濃度；分子信標探針濃度；雜交溫度、雜交時間、雜交液配方；點樣大小與點樣濃度；陰-陽性區(qū)分的臨界值等。通用TB-MB芯片的臨床應用和方法學比較。 3.NCBI數(shù)據(jù)庫查找4種結(jié)核桿菌耐藥基因

6、主要突變區(qū)域(多重位點)。針對以上位點設計擴增體系進行擴增體系優(yōu)化。針對以上位點設計TB分子信標探針及相應單側(cè)延長臂分子信標探針。進行TB耐藥突變位點單側(cè)延長臂分子信標探針芯片表面雜交系列實驗：雜交溫度梯度實驗(選擇45℃、50℃、55℃、60℃、65℃作雜交溫度)。雜交時間梯度實驗(分2、4、6、8、10、12、14、16、18h不等時間段雜交)。靶序列濃度梯度雜交實驗(分0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0

7、.07、0.08、0.09uM等不同濃度雜交)。熒光顯微鏡的觀測。 4.針對以上位點進行的相應TB臨床耐藥分離株PCR擴增。各位點TB臨床耐藥分離株PCR擴增產(chǎn)物測序。在已摸索出的最佳條件下運用多重MB探針芯片對各位點TB臨床耐藥分離株PCR產(chǎn)物進行雜交反應并與測序結(jié)果對照。 主要結(jié)果： 1.優(yōu)化后的通用TB-PCR反應體系MgCl2、引物以及dNTP最佳終濃度分別為：4mmol/l、0.04μmol/l以及0.

8、2mmol/l；退火溫度為55℃。測序結(jié)果與GenBank中公布的序列完全一致。體系對其它細菌無交叉反應。檢測限度為1拷貝。水浴、PCR儀、恒溫搖床的最適雜交溫度和適雜時間分別為：55℃，16h；65℃，4h；50℃，7h。熒光顯微鏡觀測MB-PCR雜交陽性產(chǎn)物、MB-PCR雜交陰性產(chǎn)物熒光強度差異明顯(p＜0.01)。分子信標熒光-淬滅效率較高的有：Cy3-BDH、FAM-DABCLYE；較差的有：Cy3-DABCLYE、FAM-BD

9、H。 2.分子信標莖臂生物素-親和素(biotin-avidin)修飾有相當技術難度。單側(cè)延長臂分子信標采用淬滅分子中間標記，莖結(jié)構單側(cè)(淬滅分子一側(cè))延長臂，能很好的結(jié)合在芯片上，且修飾技術難度低、特異性好。oligo探針最適濃度為40μmol/L。三種雜交液的雜交結(jié)果比較：0.15％SDS效果好于0.2％SDS，10×SSC效果好于5×SSC。Cy3-BDH探針濃度約15μmol/L、FAM-DABCLYE探針濃度約9μmo

10、l/L時雜交反應達到7h以上可檢測到較強信號。隨著點樣直徑的縮小，同濃度樣本熒光強度不變；隨著濃度的倍比減小，點樣熒光強度也減?。粚^理想?yún)^(qū)分陰陽性的信號強度：Cy3-BDH濃度約10μmol/L，F(xiàn)AM-DABCLYE濃度約15μmol/L。TB-MB芯片對臨床標本總檢出率為57.5％(23/40)，高于涂片27.5％(11/40)和培養(yǎng)35％(14/40)，經(jīng)統(tǒng)計學處理TB-MB芯片與涂片、培養(yǎng)相比差異有顯著性(分別為)x2=7.3

11、66，P＜0.01；x2=32.281，P＜0.01)。 3.準確定位4種結(jié)核桿菌耐藥主要突變基因區(qū)域：耐鏈霉素：rpsl(43、88)、rrs；耐異煙肼：katG(315、463)；耐乙胺丁醇：embB(285、303、306、330)；耐利福平：ropB突變核心區(qū)域、擴充的突變區(qū)域。針對以上位點設計了擴增體系并成功優(yōu)化了擴增體系，均順利擴增出特異性目的片段。針對以上位點成功設計出分子信標探針及相應單側(cè)延長臂分子信標探針。完成

12、了各位點分子信標探針芯片表面雜交系列實驗。按rps143、rps188、rrs、katG315、katG463、embB285、embB303、embB306、embB330、ropB-MB1-1、ropB-MB1-2、ropB-MB1-3、ropB-MB1-4、ropB-MB2-1、ropB-MB2-2順序，各位點最佳雜交條件分別是：(雜交溫度梯度實驗：50℃、50℃、50℃、55℃、65℃、55℃、55℃、45℃、60℃、60℃、5

13、0℃、65℃、60℃、55℃、55℃；雜交時間梯度實驗：12、14、14、16、12、12、8、14、10、10、10、8、12、10、8h；靶序列濃度梯度雜交實驗：0.06、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.07、0.05、0.05、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.04uM)。熒光顯微鏡的觀測各位點熒光信號陽-陰性區(qū)別明顯。 4.4種TB耐藥主要突變基因區(qū)域進行的相應臨床耐藥分離株PC

14、R均順利擴增。擴增產(chǎn)物測序：耐鏈霉素rpsL基因43位密碼子突變率65％，密碼子88為60％，且75％與43codon突變株重疊。Rrs突變率為15％，耐SM突變率多位點重復率較高。耐異煙肼KatG315codon突變率為50％，463位點突變率為37％。耐乙胺丁醇子密碼子285密碼子突變率為15％；303密碼子突變率為6％；306密碼子突變率為70％；330密碼子突變率為3％；12％未找到突變點，306密碼子突變率最多。耐利福平rpo

15、B全部找到該區(qū)段內(nèi)的突變位點且較復雜，多位點同時突變較多。成功運用多重MB探針芯片對各位點TB臨床耐藥分離株PCR產(chǎn)物進行雜交反應，與測序結(jié)果對比有較好的一致性。 結(jié)論： 1、本研究采用多重分子信標探針成功實現(xiàn)了對4種結(jié)核桿菌耐藥基因主要突變區(qū)域多重靶點的檢測。研究摸索了對單堿基靶點突變具高靈敏及特異檢測能力的分子信標探針設計模型及其雜交檢測技術。 2、設計合成了結(jié)核桿菌通用高特異性MB探針，并進行了擴增中/擴增

16、后加入通用MB探針系列實驗。通過凝膠成像分析儀、熒光分光光度計、熒光顯微鏡等各種途徑對通用MB探針雜交熒光觀測條件進行了摸索，為熒光芯片運用作了技術儲備。通過與傳統(tǒng)方法臨床標本進行結(jié)核桿菌檢測，證實了通用TB-MB探針熒光芯片具有較高的陽性檢出率、靈敏性、特異性。 3、單側(cè)延長臂分子信標探針的設計發(fā)明對解決分子信標探針在芯片表面的固定難題提供了一種簡單思路。對解決傳統(tǒng)MB探針莖臂修蝕技術難，雜交無特異性、在多分子檢測的中高密度芯

17、片領域難以實際應用等難點具積極意義。 4、建立了針對4種結(jié)核桿菌耐藥基因各突變位點的PCR擴增體系，設計、合成、篩選了相應的多重TB分子信標探針及其單側(cè)延長臂分子信標探針，并完成進行MB探針芯片雜交優(yōu)化系列實驗和條件優(yōu)化。 5、成功運用多重MB探針芯片檢測各位點TB臨床耐藥分離株PCR產(chǎn)物的雜交反應。并與測序?qū)φ沼休^好的一致性。說明對分子信標探針對單堿基突變具較高的靈敏和特異檢測能力，引入于基因芯片領域，實現(xiàn)了對多靶點堿