整合子介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥分子機(jī)制.pdf

1、[研究背景]：鮑曼不動(dòng)桿菌已成為引起嚴(yán)重致死性院內(nèi)感染重要病原菌，常表現(xiàn)為對(duì)多種抗菌藥物耐藥即多重耐藥，易引起醫(yī)院獲得性肺炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、軟組織感染以及腹腔內(nèi)感染等嚴(yán)重感染。特別是近年國(guó)內(nèi)外報(bào)道耐碳青霉烯類(lèi)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，在重癥監(jiān)護(hù)病房、血液病房引起爆發(fā)流行，病死率高。鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療越來(lái)越困難，臨床治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此加強(qiáng)對(duì)其耐藥性監(jiān)測(cè)，研究其耐藥分子機(jī)制，對(duì)于控制和治療鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染具

2、有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 [目的]：篩選臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中多重耐藥菌株，測(cè)定其耐藥表型；測(cè)定多重耐藥菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的表型和基因型；對(duì)臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中含整合酶分布狀況進(jìn)行研究，用PCR方法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌中整合酶基因及類(lèi)型；測(cè)定整合子可變區(qū)耐藥基因，分析整合子結(jié)構(gòu)，探討整合子陽(yáng)性菌株中耐藥基因?qū)︴U曼不動(dòng)桿菌耐藥表型的影響。 [方法]：(1)利用常規(guī)紙片擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)從北京地區(qū)醫(yī)院臨床分離的82株鮑曼不動(dòng)桿菌中篩選出多

3、重耐藥的菌株(至少對(duì)兩種及兩種以上抗菌藥物耐藥)，采用瓊脂二倍稀釋法檢測(cè)24種抗菌藥物對(duì)82株鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥表型。(2)采用改良三維試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序等方法測(cè)定耐藥菌株的AmpC酶和ESBLs、碳青霉烯酶的表型及基因型。用RAPD分型方法分析耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的基因同源性，分析產(chǎn)酶情況不同的菌株在耐藥表型方面的差異。初步探討耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥機(jī)制。(3)設(shè)計(jì)3類(lèi)整合酶基因特異性引物(IntI1，2，3)進(jìn)行PC

4、R擴(kuò)增反應(yīng)和DNA測(cè)序，測(cè)定82株鮑曼不動(dòng)桿菌中整合酶基因及類(lèi)型，分析整合子陽(yáng)性菌株在耐藥表型方面的差異。(4)以整合酶陽(yáng)性的菌株為研究對(duì)象，用PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序方法測(cè)定整合子可變區(qū)基因盒，通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序產(chǎn)物結(jié)果直接在GeneBank上進(jìn)行序列比對(duì)分析，了解內(nèi)插耐藥基因情況，分析整合子結(jié)構(gòu)。 [結(jié)果]：(1)82株不動(dòng)桿菌經(jīng)常規(guī)生化反應(yīng)和Vitek系統(tǒng)進(jìn)一步核查鑒定，確定為鮑曼不動(dòng)桿菌。6種抗菌藥物紙片藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，

5、有68株細(xì)菌為多重耐藥菌株，其中耐亞胺培南菌株62株，6株為亞胺培南敏感但對(duì)其他多種抗菌藥物耐藥，單藥耐藥菌株8株，其他6株為敏感菌。68株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)24種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果顯示，除左氧沙星和加替沙星耐藥率低外，其余抗菌藥物耐藥率均90％以上，對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物、第三代頭孢菌素均100％耐藥，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率在80％以上。(2)三維試驗(yàn)結(jié)果顯示，68株多重耐藥菌株中，60株同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和碳青霉

6、烯酶，5株單產(chǎn)AmpC酶，1株產(chǎn)ESBLs酶，2株僅產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶。所有碳青霉烯耐藥菌株均未測(cè)到金屬酶。β-內(nèi)酰胺酶基因型PCR測(cè)定結(jié)果顯示，均測(cè)到TEM-1型廣譜β-內(nèi)酰胺酶，未測(cè)到SHV、CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶。1株產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的基因型不是TEM、SHV變異型、CTX-M型，是否為其他基因型尚待進(jìn)一步探討。62株亞胺培南耐藥菌株中除2株細(xì)菌外，60株菌株均測(cè)到碳青霉烯酶OXA-23基因型，未測(cè)到OXA-24及金屬酶(IMP

7、和VIM型)。60株同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶和AmpC多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)24種抗菌藥物的敏感性結(jié)果顯示，除加替沙星耐藥率低外，對(duì)哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、氨芐西林/舒巴坦、替卡西林/克拉維酸100％耐藥，對(duì)其他抗菌藥物耐藥率均90％以上。RAPD結(jié)果顯示，68株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中分7個(gè)克隆株，其中A型5株、B型8株，C型5株，D型46株，E型2株，F(xiàn)型1株，G型1株。(3)對(duì)68株多重耐藥菌株整合酶基因測(cè)定結(jié)果顯示，19株(27

8、.9％)Ⅰ類(lèi)整合酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性，其中B型克隆株中8株，C型克隆株3株，D型克隆株8株，在GeneBank上經(jīng)Blast比對(duì)結(jié)果100％與AJ640197.1同源。未測(cè)到Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶基因。同時(shí)也對(duì)8株單藥耐藥和6株敏感鮑曼不動(dòng)桿菌菌株整合酶基因進(jìn)行整合酶基因測(cè)定，結(jié)果均未測(cè)到整合酶基因。在1類(lèi)整合子陽(yáng)性和陰性菌株的耐藥性的對(duì)比分析中發(fā)現(xiàn)，整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)等抗菌藥物耐藥率菌明顯高于整合子陰性菌，提示整合子對(duì)細(xì)菌耐藥性的播

9、散有重要的作用。(4)對(duì)19株整合酶陽(yáng)性菌株進(jìn)行可變區(qū)PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)13株(68.1％)出現(xiàn)6種不同長(zhǎng)度DNA片段(1.3-3kb)，其中7株出現(xiàn)2476bp條帶，測(cè)序結(jié)果為含4個(gè)開(kāi)放讀碼框，GeneBank序列比對(duì)結(jié)果與aacC1、orf1、orfx’和aadDA1100％同源，對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥，登錄號(hào)為AJ784787.1；2株Aba-b04和Aba-38為2235bp，測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果含3個(gè)開(kāi)放讀碼框，BlaPSE-1

10、-orfx'-aadA1，其中BlaPSE-1為編碼β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，是國(guó)內(nèi)首次在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)，aadA1對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥；1株(Aba-b27)為含2307bp條帶，測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)含3個(gè)開(kāi)放讀碼框與aacA4-CatB8-aadA1100％同源，分別對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物和氯霉素耐藥，登錄號(hào)為AY922988；1株(Aba-b32)發(fā)現(xiàn)1848bp條帶測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果含3個(gè)開(kāi)放讀碼框與aadA2-orfF-d

11、hfrXII100％同源，分別對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物和磺胺類(lèi)抗菌藥物耐藥，登錄號(hào)為AY748453；1株(Aba-b36)發(fā)現(xiàn)1304bp條帶，測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果含2個(gè)開(kāi)放讀碼框與aar-3-aacA4100％同源，分別對(duì)利福平和氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥，登錄號(hào)為DQ174291。1株(Aba-a48)出現(xiàn)1664bp條帶，測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果含2個(gè)開(kāi)放讀碼框與aacA4-aadA1100％同源，對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥，登錄號(hào)為DQ1742

12、91和AY887066。另有6株未擴(kuò)增出條帶，原因可能是耐藥基因片段太長(zhǎng)無(wú)法有效擴(kuò)增或3'-CS缺失。 [結(jié)論](1)北京地區(qū)醫(yī)院中多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)敏感性明顯下降，對(duì)其他藥物尤其是第三、四代頭孢菌素類(lèi)及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑敏感性也顯著降低，同時(shí)對(duì)磺胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)耐藥率較高。(2)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶：TEM-1酶、AmpC酶，OXA-23型碳青霉烯酶。同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和碳青霉烯酶多

13、重耐藥菌株比例較大。耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶基因型為OXA-23型。RAPD結(jié)果顯示，68株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中分7個(gè)克隆株，提示多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株來(lái)源有很大差異，是由多個(gè)獨(dú)立來(lái)源發(fā)展而來(lái)的，可能與抗菌藥物選擇壓力相關(guān)。(3)19株細(xì)菌帶有Ⅰ類(lèi)整合酶基因，占多重耐藥菌株27.9％。提示Ⅰ類(lèi)整合子在臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌菌株耐藥基因傳播中占有較重要地位。(4)耐藥基因盒中發(fā)現(xiàn)分別水解氨基糖苷類(lèi)、氯霉素、利福平、磺胺類(lèi)及

14、β-內(nèi)酰胺類(lèi)的耐藥基因，以氨基糖苷類(lèi)耐藥基因最多見(jiàn)，其中BlaPSE-1是首次在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)。(5)整合子結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同耐藥基因盒排列結(jié)構(gòu)的整合子，其中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的排列BlaPSE-1-orfx'-aadA1和aacA4-aadA1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)同一類(lèi)耐藥基因aacA4可在不同菌株間檢出。提示在藥物持續(xù)選擇壓力下，不僅耐藥基因盒上耐藥基因本身發(fā)生變異，也促使整合子整合其他耐藥基因，耐藥基因盒可在不同菌株間轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多重耐藥。(